入出境船舶压舱水微生物学检测规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准入出境船舶压舱水微生物学检测规程Mierobiologicalexaminationrulesforballastwaterof2007-04-06发布中，华人民共，和国国家质量监督检验检疫总局本标准附录A、附录B,附录C均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位；中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本标准主要起草人；王海军、李俊成、张顺合、聂维忠、李德昕、王林、黄廷学。本标准系出入境检验检疫首次发布的行业标准。入出境船舶压舱水微生物学检测规程8.2大肠菌群与粪大肠菌群检测按GB/T4789,3规定执行。8.5致病性埃希氏大肠杆菌检测按GB/T4789.6规定执行。8.6霍乱弧菌检测按SN/T1239规定执行。9.1根据检测结果出具报告。9.2对发现的新菌株和毒株及未能鉴定的菌株送专业实验室(资料性附录)压舱水集菌和富集病毒方法A.1过滤膜集菌方法滤膜集菌器材主要有；——过滤装置；——灭菌微孔过滤膜；孔径0.45pm、膜直径47mm,具3mm疏水边缘；——灭菌过滤膜杯；容量100mL,直径47mmt——灭菌无齿镊子。A.1.2.1无菌操作取微孔过滤膜平铺于过滤膜杯底部。将过滤膜杯固定于过滤装置上。将水样注入过滤杯中，启动抽滤系统。水样抽滤完毕，用无齿镊夹取微孔滤膜边缘部分，此滤膜可以直接置培养基中培养或增菌液中增菌。能膜直接用于培养时，截留细菌面应向上，并与培养基面紧贴，两者间不得留有气泡。A.2浓集病毒方法A.2.1石英粉抽滤法石英粉抽滤材料主要包括：——水样20L;—30pm~100pm直径的石英粉柱：——pH9.00,15mol/L甘氨酸-氧氧化钠溶液：——聚乙二醇PEG(分子量6000)。A.2.1.2操作步骤用1mol/L盐酸将海水样pH调至3.5.按最终浓度0.0005mol/1.加入0.5mol/L.氯化铝(30ml.)混匀，静置30min。用石英粉柱抽滤，速度为101./h。用甘氨酸-氢氧化钠溶液分3次洗脱。收集洗脱液，置透析袋中用PEG包埋，4C浓缩至6ml.左右，冻存备检。A.2.2高分子聚合物法高分子聚合物法器材主要有；——分液漏斗：(资料性附录)甲型肝炎病毒检测方法B.1免疫电镜技术检测甲型肝炎病毒B.1.1材料与试剂材料与试剂包括：——压舱水浓缩液0.2mL~0.5mL;——抗-HAV血清0.1mL;B.1.2操作步骤B.1.2.1取压舱水浓缩液0.2ml.,加入抗-HAV血清0.1mL,摇匀，置37℃1h,然后置4℃过夜。B.1.2.2次目取出后，12000r/min离心1,5h,收集沉淀物。B.1.2.3沉淀物用0.1ml.～0.2ml.燕馏水重溶后滴铜网。B.1.2.5电镜下观察，凝集成片的27mm大小的病毒颗粒为阳性。B.2RT-PCR法检测甲型肝炎病毒(HAV)B.2.1材料与试剂材料与试剂包括：——压舱水浓缩液；——RNA提取试剂盒：——RT-PCR试剂盒：——2%琼脂糖凝胶；——甲型肝炎病毒检测常用的引物为；P;HAV+2020;5'ACAGATATACAAAGTCAG3B.2.2操作步骤B.2.2.1用RNA提取试剂盒提取样品的总RNA。B.2.2.2用DEPC水10倍系列稀释至10-,取10°、10-'、10-³做逆转录及PCR扩增，扩增时每个稀释度各做4个平行管。B.2.2.3RT-PCR反应：RT-PCR反应混合液根据实验所做样品的份数及试剂盒使用说明书进行配制，混匀后再将混合液按要求分入PCR各管内，放入PCR仪进行PCR反应。B.2.2.4RT-PCR反应条件150℃反应30min(合成第一链cDNA);94C反应2min(变性);94C0.5min,52C0.5min,72C1min,33个循环：72℃反应10min;4℃反应1min。B.2.2.5同时作阳性和阴性对照。8(资料性附录)轮状病毒检测方法C.1电镜检测C.1.1材料与试剂材料与试剂包括：——压舱水浓缩液0.2mL~0.5mL;——铜网(直径约为2mm~3mm),每网为200目：——支持膜(以0.25%聚乙烯醇缩甲醛膜和0.5%火面胶膜制备铜网上的支持膜，干燥后，喷镀薄薄一层碳膜，备用):——血清：兔抗RV诊断血清，其效价1:64(对流免疫电泳)以上，用时以生理盐水作1:20~——染色液：2.5%磷钨酸。C.1.2操作步骤C.1.2.1取压舱水浓缩液约0.2mL～0.5mL。C.1.2.2用微量吸液器滴入有支持膜的铜网上，1min~2min后，用滤纸轻轻吸走铜网上的液体。C.1.2.3用染液染1分钟，吸走多余染液，干燥后电镜观察。C.1.2.4干燥后上电镜观察。形态学平均直径70nm,在40nm～45nm的六角形核心之外，可以清楚的分辨出一个呈故射型亚单位构成的内壳和薄而光滑的外壳为阳性。C.2单管半套式RT-PCR法检测轮状病毒(RV)C.2.1材料与试剂材料与试剂包括：——压舱水浓缩液；——RNA提取试剂盒：——RT-PCR检测试剂盒：——1.4%琼脂糖凝胶；——以轮状病毒VP7基因的高保守区段设计各血清型通用的引物，碱基序列分别为：P₁:5*-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-2';P₂:5'GTATGGTATTGAATATCAC-3';P:5*-GATCCTGTTGGCCATCC-3';其中，P和P,P,为半套式PCR内引物对，所对应的碱基位置分别为1<28,51～71.376～392。C.2.2操作步骤；C.2.2.1用RNA提取试剂盒提取样品轮状病毒的总RNA。C.2.2.2将轮状病毒RNA模板进行梯度稀释后，分别做RT-PCR和单管半套式RT-PCR扩增。C.2.2.3RTPCR的反应体系(25pL);2.5pL10×PCRbuffer,200gmol/LdNTP,20URNasin,P、P₃各0.3pmol/L,MLV200U,TaqE1.5U,RNA模板2.5pL。C.2.2.4第二步PCR反应液加在反应管内，包括2.5μl.10×PCRbuffer.200gmol/L.的dNTP,P₂、C.2.2.5第一步RT-PCR扩增条件：50C30min合成第一链eDNA;然后94℃变性5min:94C40s,55℃50s,72C40s,循环30次；72C7min,以确保扩增产物充分延伸。C.2.2.6以大于8000g的转速离心15s,使悬浮于反应