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文档简介

苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌检疫鉴定方法本标准规定了植物检疫中苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫整定方法。本标准适用于来自苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌发生国家或地区相关寄主新鲜果实中的苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2077进出境苹果检疫规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。无论是无性繁殖或有性繁殖,结构简单的或复杂的真菌产孢机构,统称为子实体。分生孢子器sporudochidium半知菌球壳孢目真菌形成的一种子实体,球形或瓶形,产生分生孢子。半知菌的分生孢子着生在散生,束生的分生孢子梗或分生泡子座上,或着生在分生孢子盘或分生孢子器内。分生孢子的形态变化很大,大致可分为7种类型。4方法原理4.1分类地位学名:SphaerupsispyriputrescensXiao苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌属真菌界(Fungi),半知菌亚门(Deuteromyeotina),腔菌纲(Coelo4.2检疲鉴定依据以病菌在寄主上的症状特点,病菌形态学特征及其培养特性、病菌种的特征以及基因组序列作为苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定依据,必要时辅助进行致病性测定(见附录A.附录B.附录C、5设备及用具5.1仪器设备体视显微镜、生物显微镜、电子天平(感量0.01g)、高压灭菌器、超净工作台、生物培养箱(带荧光灯)、高速离心机、PCR仅、实时荧光PCR仪、凝胶电泳和成像系统。5.2实验用具杯(500mL)、量筒(500ml.)、三角瓶(250mL)、载玻片、盖玻片、微量移液器(可调式范围:2.5gL~1000pL)、移液器枪头(10pL、100pl.,1000pL)。6试剂和培养基1%NaClO溶液,无水乙醇,70%乙醇,无菌双蒸水,2%CTABDNA提取缓冲液、10%SDS溶液、3mol/L.醋酸的溶液、PCR试剂《包括Tag聚合酶、dNTP、缓冲液》、实时荧光PCR混合液、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、Tris-HCl、EDTA、ITS引物,实时荧光PCR引物和探针、琼脂糖,DNA相对分子质量标准(DL2000Marker),0.5×TBE电泳缓冲液。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(见附录A)。7标准菌株SphaeropsispyripntrescensXiao&.J.D.Reg口岸查验进境水果时,按SN/T2077对来自疫区的苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌寄主的新鲜果实进行抽样与取样。9检验方法9.1现场检验将有明显病症病果置于体视显微镜下检查,或直接挑取病部病原体制成玻片,置于生物显微镜下检查,观察记录有无病菌的分生孢子座、分生孢子器以及分生孢子的形态特征和着生方式,并测量其大小。9.2实验室检验9.2.1显微镜检将有明显病症病果置于体视显微镜下检查,或直接挑取病部病原体制成玻片,置于生物显微镜下检查,观察记录有无病菌的分生孢子座,分生孢子器以及分生孢子的形态特征和着生方式,并测量其大小。9.2.2保湿培养如病果上只有可疑病状面无明显病症,则将病果置于样品袋中,于20℃~25℃下保湿培养.定期观察症状的变化,并进行显微镜检或分离培养。9.2.3分离培养性状和形态学观察取可疑病果用70%的乙醇表面消毒,超净工作台上自然干燥,取病健交界的组织数块(大小约5mm×5mm>.置于PDA平板上,于20℃~25℃黑暗下近紫外灯下培养.待菌落出现后观察菌落的形态、颜色,大小及子实体等培养性状,显微镜检分生孢子的形态特征。9.2.4病原菌致病性测定(必要时做)将Sphaeropxispyriputrescens在PDA培养基上交替培养(12h光照/12h黑暗)3周,诱导产生分生泡子,用无菌水配制孢子悬浮液,浓度为1×10¹个孢子/ml。取采收前2周~4周没有接触过杀菌剂的富士苹果进行致病性测定。果实用0.5%NaClO溶液表面消毒5min.无菌水漂洗3次,无菌条件下干燥后,用直径为4mm的针头,扎入果实内形成深4mm的伤口,注入20μL孢子悬浮液进行接种,以接种无菌水作为对照。接种果实用网套包裹放于纸箱中,用纤维板隔开,0℃下保存,一般6周~8周可以观察到接种Sphaeropsispyripatrescens的果实呈现腐烂症状。梨果实蒂部和萼端致病性测定,用无菌解剖刀在果实的蒂部平切造成1cm伤口,用无菌纱布(2cm×2cm)蘸下孢子悬浮液,覆盖伤口接种,以范有无菌水的纱布包裹的伤口作为对照。接种水果放在铝盘上,再将盘子置于有水的密闭容器中(20℃~22℃)过夜。然后去掉接种纱布,将果实放于纸箱上,用纤维板隔开,0℃下保存,一般2个~3个月后接种病菌果实呈现腐烂症状。每个菌株接种不少于5个。定期观察接种果实的发病情况,发病后按照前述9.2.3方法分离病菌,对柯赫法则验证的菌株进行形态学鉴定。9.2.5分子生物学鉴定CTAB法:参照《分子克隆实验指南(第三版)》;或参照公司真菌DNA提取试剂盒,见附录B。对提取的DNA,用设计的通用引物扩增ITS区域,PCR产物纯化后调序,BLAST比对分析,见附录C。9.2.5.3实时荧光PCR检测对提取的DNA,用设计的特异性引物和探针进行实时荧光PCR检测。实时荧光PCR反应体系和条件见附录D,10.1症状特征果实蒂部和萼部腐烂是苹果和梨果实球壳孢腐烂病主要症状。发病组织表面褐色,随着病情的发展,病庭表面形成黑色的分生孢子器,分生孢子器分布于果皮的表面或者半埋生于组织内。发病组织表皮褐色或深褐色,果肉褐色,随时间延长病部颜色加深。切开病果散发类似“绷带”一样的气味。10.2病菌培养特征分离物菌落在20℃黑暗下培养初期为液密,无色,7d~14d后,菌丝逐渐变为黄色,菌落中有黄色素沉积是识别该菌的主要特征。转入12h光照/12h黑暗的交替培养,3周后可于菌落上形成黑色的子座。10.3分生孢子形态特征分生孢子褐色,单孢,一端膨大,末端扁平,分生孢子大小(14μm~17μm)×(8ym~10gm)。10.4致病性结果(必要时采用致病性测定)接种果实应呈现典型的苹果和梨果实球壳孢腐烂病的典型症状,经病原菌再分离获得的纯菌株应具有与原菌株保持一致的病原特征,对照不出现苹果和梨果实球壳孢腐烂病症状。10.5病菌ITS序列分析经1%琼脂糖凝胶电泳分析,PCR扩增产物的片断大小大约600bp。测序后进行BLAST比对,序列与GenBank中已知的苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌同源性为100%。10.6实时荧光PCR检测进行实时荧光PCR检测后,看有无Ct值。在常规的生物学方法检测中.若发现症状,病原特征及致病性测定(必要时采用)与第10章描述特征相吻合,则判定检出果实和梨球壳孢腐烂病菌。在分子生物学方法检测中,如果待测样品的序列与GenBank中已知的苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌同源性为100%或待测样品的Ct值小于或等于35时,如果症状或者病原菌培养性状与第10章鉴定特征吻合的,则判定检出苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌。12样品和资料的保存12.1菌种和DNA样品的保藏苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌纯分离物要标注菌株来源、寄主、分离时间、鉴定人;南株在含20%甘油的冻存管中于一80℃保存,或将菌株转接在PDA斜面上培养,待菌丝体张满斜面后,置于4℃下保存,并定期(180d)转管。病菌基因组DNA样品于-20℃下保存。保存期满后,需经灭菌处理12.2检验资料的保存妥善保存检验资料,以备复验、谈判和仲裁。检验报告应注明检验日期、方法、结果等,并有检验人2%CTAB,2%PVP,1,4mol/I.NaCl,100mmol/L.TrisHCl(pH8,0),25mmol/I.EDTA(规范性附录)真菌DNA提取方法真菌DNA的提取采用CTAB方法,具体步骤如下:a)称取0.2g菌丝,在液氮中研磨成粉末:b)转入1mL.65℃预热的抽提缓冲液(CTAB)中,颜例混匀,65℃温育5min,中间混匀两次:c)加入等体积三氯甲烷/苯酚(1/1)混匀,12000r/min离心15min,取上清液,等体积三氯甲烷/苯酚再抽提一次;d)上清液加入1/10体积3mol/L.醋酸钠溶液轻轻混匀,再加入2倍体积冷冻无水乙醇于-20℃沉淀30mim,12000r/min离心10min;e)沉淀用70%乙醇洗两遍,置于37℃温箱干燥后,用TE溶解,1.0%琼脂糖电泳检测,-20℃保存。10×PCR缓冲液(含MgCl₂)5dNTP(每2.5mmol/L.)422195*-CCCACCCTCTGTCTACAGTAa'-GAACCAAGAGATOCGTTGTTGA5-FAM-ACTCAGAOGACACTGATGATATGGGTTT-T111[1]XisoCL,RogersJD.2004.Apostharvestfruitrotind"Anjoupearscausecenssanov.PlantDis88:114-118.[2]RogersJD.BoalRI.2004.FirstreportofanewpostharvestfruitrSphaeropsispyriputrescens.PlantDis88;223.[3]SwartWJ,WingfieldMJ,PalmerMA,BlanchetteisolatesofSphaeropsissapinea.Phytopathology81:489-493.[4]MeheriukM.1993.CAstorageconditiensfortheSixthInternationalControlledAtmosphe

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