现代酶工程抗体酶或催化抗体

抗体酶：20世纪80年代以来出现一个含有催化活性蛋白质，是利用生物学和化学结果在分子水平上交叉渗透研究产物；其本质上是免疫球蛋白，只是在其易变区被赋予了酶属性，所以抗体酶又称为催化抗体（CatalyticAntibody)。现代酶工程抗体酶或催化抗体第1页Pauling过渡态理论和预言抗体若能与化学反应过渡态结合，则这么抗体必含有催化性能观点抗体一旦能与过渡态结合，它就含有酶在温和条件下高效、转移地催化化学反应性质，依这类推，抗体若能与过渡态相同物结合，则它也会与化学反应过程中过渡态结合，这么抗体亦含有催化性能Jencks于1969年提出意义现代酶工程抗体酶或催化抗体第2页Pauling和Jencks理论催化抗体难单克隆技术1986年，Lerner和Schultz分别成功催化抗体实现现代酶工程抗体酶或催化抗体第3页——Lerner(1984)提出：若以过渡态类似物为半抗原，则其诱发产生抗体应该与该类似物含有互补构象；这种抗体与底物结合后，就能够诱导底物进入过渡态结构，从而引发催化作用。

——1986年Lerner研究组在《Science》上发表了抗体酶研究试验结果，标志着抗体酶研究进入了一个新阶段。现代酶工程抗体酶或催化抗体第4页催化抗体自1986年诞生之日起，就一直是科学界高度关注对象，催化抗体研究是当今科学前沿多学科交汇点之一研究范围不停拓宽，研究结果层出不穷，采取技术日益先进突破了传统胶束、大分子、配位化合物等模拟酶研究框框，开创了催化剂研究和制备崭新领域在催化化学、反应动力学、医学、制药学等很多领域无可限量应用前景现代酶工程抗体酶或催化抗体第5页催化抗体定义抗体酶或催化抗体经过一系列化学与生物技术方法制备出含有催化活性抗体该抗体除了含有对应免疫学性质外，还含有类似于酶能催化一些反应特征现代酶工程抗体酶或催化抗体第6页催化抗体与酶共同点催化抗体与酶共同点抗体与酶都是蛋白质分子酶与底物结合及抗体与抗原结合都是高度专一性能高选择性地与靶分子结合现代酶工程抗体酶或催化抗体第7页催化抗体与酶不一样点催化抗体与酶不一样点酶与高能态过渡态分子相结合抗体则与抗原（基态分子）相结合大大降低化学反应活化能，高选择性、高效率地催化化学反应，使之能在温和条件下得以实现抗体特异性地结合抗原并帮助巨噬细胞摄入且摧毁抗原现代酶工程抗体酶或催化抗体第8页半抗原与催化性抗体半抗原：是一类小分子化合物，本身不能诱导免疫应答，只有当共价结合到含有免疫性蛋白质后，注射动物才能诱导出与半抗原特异性结合抗体。假如半抗原是酶过分态结构类似物，则有可能取得含有催化活性抗体，也就是抗体酶。实例：以一羧基酯和酰胺水解为例，依据反应机理，其过渡态应该为一个四面体结构，以含有四面体结构高能中间类似物作为半抗原，均能取得预期抗体酶；该抗体酶与过渡态类似物含有完全互补立体结构。现代酶工程抗体酶或催化抗体第9页半抗原设计中应考虑问题：产生抗体是否含有预期催化活性；能否刺激机体产生免疫应答。半抗原结构与催化抗体之间关系：半抗原结构中应含有芳香结构：含芳香结构半抗原含有较强免疫原性；催化抗体与半抗原亲和力：普通认为结合常数Ki应小于10-6mol/L，轻易取得高效催化抗体；诱导羧酸酯、酰胺水解催化抗体，能够利用含有四面体结构过渡态类似物作为半抗原；半抗原设计应考虑催化反应环境与反应机制。现代酶工程抗体酶或催化抗体第10页自从抗体酶制备成功以来，迄今已成功地开发出天然酶所催化六种酶促反应和数十种类型常规反应抗体酶。

——包含酯、羧酸和酰胺键水解反应、酰胺形成、光诱导裂解和聚合、酯交换、内酯化、Claisen重排反应、金属螯合、环氧化反应、氧化还原反应、化学上不利环化反应、肽键形成反应、脱羧反应、过氧化反应、周环反应等。现代酶工程抗体酶或催化抗体第11页抗体酶催化反应专一性相当于或超出酶反应专一性，催化速度有可到达酶催化水平。

——但普通来说，抗体酶催化反应速度比非催化反应快102~106倍，仍比天然酶催化反应速度慢102~104倍。所以，开发制备高活力抗体酶方法仍是世界各国科学家奋斗目标。

现代酶工程抗体酶或催化抗体第12页抗体酶发觉不但提供了硕士物催化过程新路径，而且能为生物学、化学和医学提供含有高度特异性人工生物催化剂，并能够依据需要使人们取得含有一些不能被酶催化或较难催化化学反应催化剂。现代酶工程抗体酶或催化抗体第13页抗体酶出现，意味着有可能出现简单有效方法，从而人们可凭主观愿望来设计蛋白质。

——这一发觉是利用生物学与化学结果在分子水平上交叉渗透研究产物。因为抗体酶对于多学科展示了较高理论和实用价值，已引发科学界广泛关注。

现代酶工程抗体酶或催化抗体第14页抗体抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌蛋白质抗体分子：由四条肽链所组成，两条重链（H链）两条轻链（L链）结合区：抗体分子上有两个抗原结合区可变区（V区）稳定区（C区）现代酶工程抗体酶或催化抗体第15页抗体结构现代酶工程抗体酶或催化抗体第16页单克隆抗体单克隆抗体(monoclonalantibody，简称McAb)将能够产生抗体B淋巴细胞和含有没有限增殖力骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能连续分泌成份单一特异性抗体。这种单一类型只针对某一特定抗原决定簇抗体分子，就是单克隆抗体现代酶工程抗体酶或催化抗体第17页单克隆抗体制备过程细胞融合：淋巴细胞杂交瘤制备动物免疫与亲本细胞选择杂交瘤细胞筛选：有限稀释法等单克隆抗体纯化现代酶工程抗体酶或催化抗体第18页催化抗体例子现代酶工程抗体酶或催化抗体第19页Haynes等在3.0Å水平上测定了含有分支酸变位酶活力抗体酶1F7与其过渡态类似物复合物三维结构。

——晶体结构数据表明，过渡态类似物是结合在可变区6个CDR(Complem-entaritydeterminativeregion,互补决定域)顶端，主要是和重链结合，有7个残基与其结合，而轻链只有1个残基与之结合。这同其它抗体是一致。现代酶工程抗体酶或催化抗体第20页 抗体与半抗原识别包含了疏水、静电和氢键等相互作用。半抗原在抗体结合部位中取向是由它2个羧基特异相互作用决定。C10羧基与Tyr-L94酚基形成氢键而固定；而C11羧基则是半抗原被包埋得较多部分。它可能与水分子形成氢键，这个水分子再同ASP-H97主链羧基氧形成氢键。现代酶工程抗体酶或催化抗体第21页过渡态类似物同1F7(A)和分支酸变位酶(B)之间相关侧链相互作用示意图现代酶工程抗体酶或催化抗体第22页Arg-95H侧链处于C-11羧基上面，这个位置也使它靠近过渡态类似物醚氧基，以提供静电互补，同时该残基还部分地保护了配体同溶剂接触。因为已经有分枝酸变位酶与上述同一过渡态类似物复合物2.2Å晶体结构，因而有可能对酶复合物与抗体酶复合物进行结构比较。现代酶工程抗体酶或催化抗体第23页结果表明，二者催化机理完全类似，但抗体酶活性部位是在相邻两个亚基界面上，从而与所结合过渡态类似物形成了广泛疏水键、离子键和极性键。现代酶工程抗体酶或催化抗体第24页过渡态类似物与酶结合解离常数Ki为3μmol，比1F7(Ki=0.6μmol)大约高5倍，说明酶与过渡态类似物之间匹配更为准确，其间有更多静电相互作用，包含2个精氨酸正电荷和一个谷氨酸负电荷，这可能就是抗体酶活力比对应天然酶活力低104倍原因。现代酶工程抗体酶或催化抗体第25页 Zhou等由N-酰基氨基酸苯酯过渡态类似物诱导产生抗体17E8，能催化甲酰甲硫氨酸（或正亮氨酸）苯酯水解生成甲酰甲硫氨酸或甲酰正亮氨酸

现代酶工程抗体酶或催化抗体第26页抗体酶17E8催化氨基酸酯反应现代酶工程抗体酶或催化抗体第27页他们在2.5Å水平上测定了17E8与其半抗原三维空间结构。17E8Fab总结构与其它抗体很类似。半抗原4结合在轻链和重链CDR3之间裂缝中，其羧基位于裂缝入口处，并被5个Tyr所包围。半抗原和抗体之间有14个氨基酸发生相互作用，包含6个氢键和范德华键。现代酶工程抗体酶或催化抗体第28页结构和动力学数据都说明抗体酶水解机理与丝氨酸蛋白酶极为相同。抗体酶结合部位含有一个Ser-His二体结构，靠近结合抗原磷原子，这与丝氨酸蛋白水解酶电荷中继系统Ser-His-ASP成份中二个相同。现代酶工程抗体酶或催化抗体第29页抗体结合部位中还含有Lys残基，用于稳定负氧离子形成和识别底物疏水口袋。

——催化抗体-半抗原复合物高分辨结构证实，抗体能够把经过天然酶进化而出现活性部位结构会聚到一起。现代酶工程抗体酶或催化抗体第30页Schultz小组制备了水解甲基对硝基苯基碳酸酯抗体48G7与其半抗原p-硝基苯基-4-羧丁基磷酸酯复合物晶体，并对其进行了X-射线衍射分析，发觉抗体结合部位共有模块含有碱性残基，它能与磷酸氧发生静电相互作用产生所谓氧阴离子洞(Oxyanionhole)。现代酶工程抗体酶或催化抗体第31页稳定半抗原是经过以下原因实现：带正电Arg-L96与带负电磷氧基靠近，形成静电吸引；由His-H35，Tyr-H33和Tyr-L94与磷氧基氧形成氢键。现代酶工程抗体酶或催化抗体第32页抗体酶48G7(右侧)与它

磷酸酯半抗原(左侧)相互作用示意图现代酶工程抗体酶或催化抗体第33页Charbonnier等对未配位催化Fab(结合抗原抗体片断)D2.3，它与底物类似物复合物以及它与磷酸酯半抗原复合物X-射线晶体结构进行了比较，结果完全说明了催化机理，发觉漏斗形沟槽使水很轻易扩散至深埋抗体中反应中心。反应中心在碱性pH下经过优先稳定带负电氧阴离子中间体而起作用，中间体是由羟基化物进攻p-硝基苯基酯底物产生。现代酶工程抗体酶或催化抗体第34页Lerner小组用定点突变技术将金属离子引入抗荧光素抗体结合部位。半抗原-抗体晶体结构显示，轻链互补决定区中3个残基在相对几何学上类似于碳酸酐酶中锌结合部位上3个组氨酸残基，所以，用组氨酸取代抗体残基Arg34L、Ser89L和Ser91L。为防止对金属结合部位可能空间障碍，用亮氨酸取代Tyr36L。经过这么改造后抗体不但仍能结合荧光素，而且还能结合Cu(ll)、Zn(ll)和Cd(ll)。这种将金属结合部位引入抗体能力十分主要，因为金属离子可催化各种类型反应。现代酶工程抗体酶或催化抗体第35页定点突变法作为蛋白质工程基本伎俩之一可准确改变蛋白质肽链上任一氨基酸残基，所以，可用来说明某一氨基酸残基在抗体结合和催化中作用。现代酶工程抗体酶或催化抗体第36页从鼠骨髓瘤细胞产生一系列能和磷酸胆碱结合抗体已被广泛研究过，有还做过X-射线衍射结构分析，发觉重链上两个氨基酸残基Arg-52H及Tyr-33H在全部能结合磷酸胆碱抗体中都存在，所以认为这两个残基反抗体结合及催化作用起关键作用。现代酶工程抗体酶或催化抗体第37页Jackson等在研究能结合磷酸胆碱抗体S107时，对Tyr-33H和Arg-52H都做了突变，分别取得4个Tyr-33突变体和3个Arg-52突变体。现代酶工程抗体酶或催化抗体第38页普通来说，Tyr-33突变体催化活力没有改变；而Arg-52突变体因为丧失了带正电侧链，催化活力显著降低。这说明，静电相互作用对S107催化作用至关主要，也说明将有催化作用残基引入到抗体中，能够增加抗体酶催化活性。现代酶工程抗体酶或催化抗体第39页有意思是Tyr-33H突变体(Y33H)可使抗体活性提升50倍(kcat=5.7min-1，Km=1.6mM)，引入组氨酸可能起广义酸碱催化作用。现代酶工程抗体酶或催化抗体第40页 用烷基磷酰胺(phosphonamidate)半抗原诱导产生单抗NPN43C9是动力学和催化机制研究最多抗体酶之一，很适合作为突变模型用于研究抗体酶结构与功效关系。现代酶工程抗体酶或催化抗体第41页Roberts等为了检测NPN43C9催化机理，用抗体结构数据库(ASD)构建了该抗体可变区三维模型。现代酶工程抗体酶或催化抗体第42页 该模型显示ArgL96胍基处于抗原结合部位底部，并与抗原磷酰胺基（该基团模拟四面体过渡态负电荷）形成盐桥。所以该模型预计ArgL96与抗体结合与催化功效相关。计算机模拟和试验结果都证实，催化抗体NPN43C9催化机理是稳定催化作用中高能过渡态。

现代酶工程抗体酶或催化抗体第43页催化抗体制备方法催化抗体制备方法拷贝法单克隆技术天然起源分离法基因工程蛋白质工程化学修饰新方法和技术不停出现稳定过渡态法现代酶工程抗体酶或催化抗体第44页1稳定过渡态法现代酶工程抗体酶或催化抗体第45页1986年发表两篇在抗体酶实践上有主要突破工作，标志着抗体酶研究进入一个崭新阶段。起初设计思想是以Pauling稳定过渡态理论为指导，即利用反应过渡态类似物作为半抗原产生抗体酶。现代酶工程抗体酶或催化抗体第46页伴随抗体酶研究深入，人们利用了酶催化业已确立催化机理：

——①稳定过渡态;

——②酸碱催化；

——③亲电和亲核催化；

——④邻近效应

使抗体酶制备方法不停扩展，当前已开发出数种产生抗体酶方法。现代酶工程抗体酶或催化抗体第47页迄今，大多数抗体酶是经过理论设计适当与反应过渡态类似小分子作为半抗原，然后让动物免疫系统产生针对半抗原抗体来取得。现代酶工程抗体酶或催化抗体第48页因为以反应过渡态类似物为半抗原诱导抗体在几何形状和电学性质上与反应过渡态互补，因而稳定了过渡态，从而加速反应。现代酶工程抗体酶或催化抗体第49页 在这方面最早设计出催化抗体是酰基转移反应，尤其象酯水解反应这么含有较低活化能反应。现代酶工程抗体酶或催化抗体第50页Lerner小组依据金属肽酶研究结果，以磷酸酯中磷酸酯为碳酸酯过渡态类似物，合成了一个含有吡啶甲酸磷酸酯化合物作为半抗原，得到一株单克隆抗体6D4，用来催化不含吡啶甲酸对应碳酸酯水解反应，使反应加速近1000倍。现代酶工程抗体酶或催化抗体第51页Schultz小组认为对硝基苯磷酰胆碱是对应羧酸二酯水解反应过渡态类似物。用这类似物作半抗原诱导产生单克隆抗体，经过筛选，找到一株MOPC167，它使该水解反应速度加紧1倍。

——研究结果表明，这些抗体酶含有酶普通特征，其催化动力学行为满足米氏方程，并含有底物特异性及pH依赖性等酶反应特征。现代酶工程抗体酶或催化抗体第52页Shultz小组利用与底物扭曲构象相同扭曲卟啉作半抗原，制备抗体可催化卟啉金属螯合反应。现代酶工程抗体酶或催化抗体第53页亚铁螯合酶是血红素生物合成路径中末端酶，可催化亚铁离子插入原卟啉生物合成。N-甲基原卟啉因为内部甲基取代而呈扭曲结构，它是此酶有力抑制剂，也与酶催化卟啉金属螯合反应过渡态类似。因为甲基卟啉抗体可催化平面结构原卟啉金属螯合，这就为该反应过渡态扭曲结构作用提供了证据。

——此工作不但说明抗体结合能可扭曲底物结构，而且表明可用抗体检验催化作用机理。现代酶工程抗体酶或催化抗体第54页Napper等人用一个环化磷酸酯作为过渡态类似物去免疫动物，得到了单克隆抗体24B11，发觉该抗体可催化外消旋羟基羧酸酯分子内环化形成内酯反应，加速反应167倍，而且首次观察到抗体酶催化反应专一性。反应产物中一个对映体含量比另一个高出94%。现代酶工程抗体酶或催化抗体第55页 Pollack等人研究也证实，抗体酶能够立体专一性地催化非活化酯水解，产物中一个对映体含量比另一个高100倍。这个结果主要意义在于，当前还没有一个化学方法能够产生立体专一性酯解催化剂。这类抗体可用于含有酸或醇功效基合成中间物手性拆分，有主要商业价值。现代酶工程抗体酶或催化抗体第56页2、抗体与半抗原互补法现代酶工程抗体酶或催化抗体第57页抗体与其配体相互作用是相当准确，抗体常含有与配体功效互补特殊功效基。已经发觉，带正电配体常能诱导出结合部位带负电残基抗体，反之亦然。现代酶工程抗体酶或催化抗体第58页抗体与半抗原之间电荷互补反抗体所含有高亲和力以及选择性识别能力起着关键作用。现代酶工程抗体酶或催化抗体第59页在开发诱导抗体酶产生各种方法时，一个主要目标是发展一个通用规则，使产生抗体结合部位催化基团和半抗原结合直接相关。现代酶工程抗体酶或催化抗体第60页Shokat等人利用抗体与半抗原之间电荷互补性，制备了针对带正电半抗原抗体，结果在抗体结合部位上产生带负电羧基，可作为普通碱基催化β-消除反应。现代酶工程抗体酶或催化抗体第61页他们采取合成季胺化合物H1作半抗原，取得6株抗体，其中有4株含有催化活性，β-氟酮底物半抗原，含有一个带正电烷基氨离子，其中一个抗体43D4-3D3可加速反应105倍。现代酶工程抗体酶或催化抗体第62页 利用抗体-半抗原互补性是产生抗体酶普通方法，可适合各类不一样反应，如缩合、异构化和水解反应等。现代酶工程抗体酶或催化抗体第63页假如经过半抗原最优化设计使带正电荷半抗原正确地模仿过渡态几何结构及全部反应键，而且半抗原和产物及底物之间都没有相同之处，那就有可能产生高活力抗体酶，甚至到达天然酶活力水平。现代酶工程抗体酶或催化抗体第64页抗体催化下一个目标是在抗原结合部位诱导出两个催化基团(两个酸、一酸一碱或两个碱)，深入增加反应速度。现代酶工程抗体酶或催化抗体第65页3拷贝法用已知酶作为抗原对动物进行第一次免疫,取得抗酶抗体;再用抗酶抗体作为抗原进行第二次免疫取得抗抗体,抗抗体实际上就是含有原来酶活性抗体酶。酶第一次免疫抗酶抗体第二次免疫抗体酶拷贝法制备抗体酶现代酶工程抗体酶或催化抗体第66页4诱导法：用设计好抗原按照一定单克隆程序，取得含有催化活性抗体。aa过渡态类似物载体蛋白抗体酶诱导法制备抗体酶现代酶工程抗体酶或催化抗体第67页催化抗体单克隆技术制备法（诱导法）

现代酶工程抗体酶或催化抗体第68页5引入法：是借助于基因工程和蛋白质工程技术，将催化基团引入到已经有底物结合能力抗体上抗原结合部位，如用寡核苷酸定点诱变技术，将特定氨基酸残基引入到抗体抗原结合位点，使其含有催化能力；也能够采取选择性化学修饰法，将人工合成或天然存在催化基团引入到抗体抗原结合部位，使其含有催化活性。现代酶工程抗体酶或催化抗体第69页6催化抗体化学修饰制备法现代酶工程抗体酶或催化抗体第70页时至今日，已经有数百种催化抗体问世现代酶工程抗体酶或催化抗体第71页四、抗体酶应用现代酶工程抗体酶或催化抗体第72页对于任何分子，几乎都可经过免疫系统产生对应抗体，而且专一性很强。抗体这种多样性标志着抗体酶应用潜力是巨大。现代酶工程抗体酶或催化抗体第73页抗体酶制备技术开发预示着能够人为生产适应各种用途，尤其是自然界不存在高效生物催化剂，展现出在生物学、医学、化学和生物工程上会