艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法

艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第1页艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第2页HIV病毒模式图HIV病毒颗粒由基因组RNA、外膜蛋白Env、衣壳蛋白Gag、逆转录酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN组成艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第3页HIV生活周期吸附－穿入－脱壳－生物合成－组装成熟和释放艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第4页HIV基因组模式图艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第5页我国及国际两种不一样抗HIV治疗方案效果比较治疗方案我国治疗病毒抑制效果国际治疗病毒抑制效果平均治疗时间(月)载量<LDL例数总例数病毒抑制率(%)AZT+ddI+NVP7.5197027.1%a45%d4T+ddI+NVP3.910613876.8%b85%注：上标字母相同表示组间无显著差异，上标字母不一样表示组间差异显著艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第6页项目周期:五年,年7月-年6月。第一期两年，年7月-年6月．全球基金将依据第一期执行情况确定后三年投入。项目实施地域：广西、贵州、湖南、江西、四川、新疆、云南７个省（自治区），35个地(州、市），76个项目县（市、区）。178云南63江西95湖南105贵州7635累计115新疆104四川135广西县（市、区）地(州、市)项目省艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第7页

总经费预算：五年总经费为9807万美元,其中全球基金支持约6374万美元,中国政府配套约3433万美元.配套百分比逐年增加，由第一年20%，增加到第五年50%。

两年经费预算：二年预算约为3100万美元,其中全球基金支持约2400万美元,中国政府配套约700万美元.

。

全球基金支持经费配套经费项目总经费广西3,605,6091,060,6364,666,245贵州2,365,191697,4453,062,636湖南2,487,791724,4503,212,241江西1,735,176506,2112,241,387四川2,623,645771,1363,394,781新疆3,137,663922,7394,060,402云南4,470,6641,310,9545,781,618中央3,511,1781,002,3204,513,498累计23,936,9176,995,89130,932,808艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第8页目标六：建立服务网络，确保针对艾滋病病人/感染者开展治疗、关心和支持等活动开展，包含母婴阻断。活动：在项目省建立和运转耐药监测试验室,开展耐药监测工作,帮助扩展和改进国家耐药监测网络各省省级建立试验室定为哨点项目县按方案采集血样艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第9页需要了解主题:

什么是耐药性?

药品作用靶点与机制?

与病毒哪些基因相关?

耐药性是怎么产生?

那些原因促使耐药性病毒株出现?

耐药性分类与耐药机制。怎样检测耐药株?

检测中注意事项。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第10页什么是HIV耐药性?

HIV耐药性是指病毒经过本身遗传变异，产生对药品抑制作用，使药品敏感性降低或不敏感现象。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第11页什么是HIV耐药性?药品浓度病毒抑制率(%)野生型病毒耐药株1000IC50,WTIC50,MT50耐药倍数IC50=50%抑制浓度艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第12页药品作用靶点与机制?艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第13页药品作用靶点与机制：全国艾滋病定点医院检测技术研讨班艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第14页AntiretroviralDrugs

NRTIs NNRTIs PIsZidovudine Nevirapine* SaquinavirDidanosine Delavirdine RitonavirStavudine Efavirenz* IndinavirLamivudine* Nelfinavir*Zalcitabine AmprenavirAbacavir Lopinavir/r

Combivir AtazanavirTrizivir FosamprenavirDidanosineECStavudineSR FTC NucleotideRTITenofovirEntryInhibitorsT20 艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第15页药品作用靶点与机制：药品作用机制核苷类逆转录酶抑制剂被靶细胞细胞酶磷酸化后，以三磷酸形式与天然三磷酸竞争，从而参加病毒DNA合成，因为该抑制剂经过化学修饰，将造成病毒DNA链合成终止。非核苷类逆转录酶抑制剂是一组结构多样化化合物，经过非竞争性方式结合于或者靠近于病毒逆转录酶活性位点，从而抑制病毒逆转录酶活性。蛋白酶抑制剂肽类似物，经过接合于病毒蛋白酶活性位点来抑制酶活性，使之不能将病毒合成多聚前体蛋白水解为病毒各种结构蛋白和酶组成个别。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第16页耐药性是怎么产生?

病毒本身原因—内因药品选择压力—外因艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第17页耐药性是怎么产生?

病毒本身原因—内因—HIV-l逆转录酶（RT）不含有DNA聚合酶校正功效，所以，在复制过程中，病毒核酸表现出高度错误倾向性。

—在病毒高速复制过程中，高频率突变在很短时间内随时发生。

每个复制周期产生一个突变点；

天天产生109

–1010

个新病毒；病毒基因组中平均每个碱基天天突变一次艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第18页耐药性是怎么产生?药品选择压力—外因—在药品选择压力下，耐药变异株完全取代药品敏感株最快能发生在14至28天内。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第19页“Wild”typevirus

(drugsusceptible)“Mutant”virus

(drugresistant)DrugPressureTIMEViralDynamicsandDrugResistanceViralLoad&ReplicationRate艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第20页ViralLoad&ReplicationRateTIMELowReplicationRate&ViralLoadLess“fit”virusPressure:DrugAPressure:DrugBPressure:DrugC,....(Combined)UseofActiveAntiretroviralAgents艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第21页耐药性是怎么产生?—耐药株是在病毒自发性、高频率基因突变中产生，在药品选择性压力下优势复制结果。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第22页那些原因促使耐药性病毒株出现?病毒载量耐药株出现时间300,0000.130,00013,00010300100301,0001.艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第23页那些原因促使耐药性病毒株出现?病毒学失败率(%)020406080100>9590-9580-9070-80<70服药依从性

(%)82.171.466.754.621.72.艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第24页那些原因促使耐药性病毒株出现?服药依从性

(%)2.艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第25页那些原因促使耐药性病毒株出现?药品配伍不妥—药代显著不一样药品配伍3.024483612时间(小时)药品浓度潜在病毒复制区IC90IC50最终一次用药

第一天第二天单药治疗S.Tayloretal.11thCROIAbs131艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第26页那些原因促使耐药性病毒株出现?—细胞周期依赖性药品AZT,D4T(活化期细胞)DDI(静止相细胞)蛋白酶抑制剂(活化期细胞)—非细胞周期依赖性药品3TC,FTC,AbacavirTenofovirNNRTIs3.药品配伍不妥—缺乏对某一时相细胞内病毒抑制或抑制不足艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第27页那些原因促使耐药性病毒株出现?—胃肠道吸收不好：呕吐，腹泻；—随意间歇服药；—与中药或其它药品同时服用。4.其它原因艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第28页什么是好治疗方案?—能快速抑制病毒；—不易产生耐药性；—可长久维持；艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第29页耐药性分类1、原发性耐药(Primaryresistance):病人在接收抗病毒治疗前产生了药品作用靶点变异，或者感染了耐药毒株，均降低抗病毒药品敏感性。在已经开展HAART国家普遍存在，感染了耐药毒株病人很轻易引发药品治疗失败。2、继发性耐药(Secondaryresistance):病人已经接收了抗病毒治疗并产生治疗失败，在药品选择压力下产生耐药。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第30页耐药机制：

核苷和核苷类似物1、破坏核苷类似物结合病毒DNA能力

M184V突变:RT酶第184位密码子氨基酸由蛋氨酸(M)变成为缬氨酸(V)

。拉米夫定(Lamivudine)Q151Mmutation:在HIV-1中出现低于

5%；HIV-2中出现频率较高。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第31页耐药机制：2、切除病毒DNA链末端核苷类似物Thymidineanaloguesmutations:突变引发ATP或者焦磷酸介导切除DNA链3‘末端核苷类似物。核苷和核苷类似物艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第32页耐药机制：非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)

突变降低了抑制剂对酶结协力。不一样于核苷逆转录酶抑制剂，其单一突变就能造成高度耐药。如K103N、Y181C。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第33页耐药机制：K103N突变机制艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第34页耐药机制：蛋白酶抑制剂

HIV蛋白酶由两个一样蛋白质链组成。这两个蛋白质链在一起就如同核桃两半，而蛋白酶活性位点就在两个半壳中间。

艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第35页突变点表示方法：

基因突变通常以字母－数字－字母书写方式来表示，第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处氨基酸，第二个字母代表在特定密码子处替换了氨基酸，中间数字表示突变点位置。比如：逆转录酶（RT）K103N突变表示逆转录酶第103位密码子氨基酸由天冬酰胺（K）变成为赖氨酸（N）。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第36页怎样检测耐药株：

当前耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测经过用药期间病毒培养进行，而基因型检测则经过分子生物学方法检测与耐药性相关病毒基因突变。基因型检测费用较低，技术也相对轻易，可在样品搜集后1～2周得到结果，但分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药品及其它药品交叉耐药等，才能对结果进行正确分析。表型检测能够直接检测病毒耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，所以当前国际上广泛应用于临床是基因型耐药检测。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第37页怎样检测耐药株：TranslationintolinearstringofaminoacidsFoldingintofunctionalproteinHIVRNA表型检测基因型检测基因型和表型检测艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第38页检测中注意事项:—在病人仍在治疗失败方案上搜集样品，可保证耐药株占总病毒量20%以上；—病毒载量<1000时,可出现假阴性。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第39页我国HIV耐药性本底抽样调查结果 1)对于RT基因区共完成对21个省区共143个样本测序，仅有2例发觉含有轻微耐药（占总样本数1.4%）

2)对于蛋白酶基因区此次调查共完成20个省区168个样本分析，仅发觉有2例样本（占总样本数1.21%）含有轻微耐药。 结论：当前我国HIV耐药性处于较低状态，对于几乎全部药品敏感，我国抗HIV药品使用假如有计划开展，应该会有很好效果，但应加强治疗依从性促进工作和耐药毒株监测工作。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第40页HIV基因型耐药性检测

（序列测定法）艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第41页检测流程病人血浆标本HIVRNA病毒cDNAHIVRT和PR基因片段序列测定结果解释RNA提取逆转录PCR扩增特定解释系统艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第42页标本新鲜EDTA抗凝血浆，或-80℃保留，防止重复冻融艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第43页病毒RNA提取（Qiagen企业试剂盒）裂解标本，灭活RNA酶加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合洗两次，去除杂质用无RNA酶缓冲液洗脱RNA搜集RNA备用优点：操作简便、快速、得率高艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第44页逆转录RNAcDNA

反应体系：

10XBuffer1ldNTP0.5l

外侧反向引物1lRNaseinhibitor0.25lM-MuLVRT0.25lDEPC水2lRNA模板5l42℃水浴1小时，95℃5分钟灭活RT艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第45页巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因第一轮扩增反应体系：

10XBuffer5lMgCl23ldNTP1l

外侧正向引物1l

外侧反向引物1lTaq酶0.5l

水29.5lcDNA模板10l

94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循环艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第46页巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因第二轮扩增反应体系：

10XBuffer5lMgCl23ldNTP1l

内侧正向引物1l

内侧反向引物1lTaq酶0.5l

水29.5l

第一轮扩增产物10l

94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循环艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第47页扩增产物判定：琼脂糖凝胶电泳艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第48页扩增产物纯化QIAquickGelextraction试剂盒核酸序列测定双脱氧链末端终止法艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第49页:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTRT:AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第50页利用网络工具确定耐药性突变并进行耐药性解释

Web站点：

HIVDrugResistanceAlgorithm2

HIVDrugResistanceAlgorithm3

HIVDrugresistancedatabase

HIVDrugResistanceAlgorithm1艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第51页高度耐药：大于60分中度耐药：30－59分低度耐药：15－29分潜在低度耐药：10－14分敏感：0－9分耐药性突变计分艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第52页HIV-1耐药性检测临床指征：（1）抗病毒治疗病毒学失败需要改变抗病毒治疗方案时应进行耐药性检测以帮助选择有效抗病毒药品。（2）抗病毒治疗病毒载量下降不理想时可进行HIV-1耐药性检测。（3）抗病毒治疗失败需要进行耐药性检测时，应该在病人仍在服药时或停药后马上（4周内）进行检测。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第53页HIV-1耐药性检测临床指征：（4）急性HIV－1感染病人进行抗病毒治疗，最好进行耐药性检测，对于选择适当抗病毒药品、取得最正确抗病毒效果很有益处。（5）对于未经抗病毒治疗慢性HIV感染者不一定要做耐药性检测，但当有迹象显示感染是耐药性HIV毒株时（比如感染来自于正在服用抗病毒药品病人），就应该进行耐药性检测。（6）不推荐对病毒载量<1000cp/ml病人做病毒载量检测，因为病毒水平太低极难扩增出目标基因片段

艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第54页耐药性检测结果解释

HIV-1耐药性不是全或无现象，基因型和表型耐药性检测结果分析和解释都有困难

全部抗病毒治疗都是联适用药，他们之间是相互协同，即对一个药品敏感性降低并不干扰同一治疗方案中其它药品抗病毒活性。

药品即使有耐药性也可能有益处，因为有耐药性突变病毒比敏感毒株复制适应性要差得多。

血清中药品水平，尤其是蛋白酶类药品是高度改变，假如能够提升血清中蛋白酶类药品浓度，低水平蛋白酶耐药性有时能够被克服。艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第55页NucleosideResistanceMutationsZidovudine 41,67,70,210,215,219(TAMs)Didanosine 65,74,75,184Zalcitabine 65,69,74,184Stavudine 41,67,70,75,210,215,219(TAMs)Lamivudine 184Abacavir 41,65,67,70,74,115,184,210,215,219MultinucleosideResistanceMultipleTAMs 41,67,70,210,215,21969insertioncomplex 41,62,67,69,70,210,215,219151complex 62,75,77,116,151艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第56页NNRTIResistanceMutationsNevirapine 100,103,106,108,181,188,190,230Delavirdine 103,181,230,236Efavirenz 100,103,108,188L,190,225,230艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法第57页ProteaseResistanceMutationsIndinavir 10,20,24,46,63,64,82,84,90Nelfinavir 30,35,36,46,71,84,88,90Ritonavir 8,10,20,33,36,54,63,71,82,84,90Saquinavir 10,24,30,46,48,54,63,64,71,73,77, 81,84,88,90Amprenavir 10,32,46,47,