核酸的生物合成与降解

1.转录的反应n1ATPn2CTPn3GTPn4UTPRNA聚合酶DNA模板RNA+（n1+n2+n3+n4)PPi定义：从DNA区段(基因)中的一条链为模板，在RNA聚合酶的催化下，以四种核苷酸为原料，按照A-U，G-C配对原则合成RNA一.概论第2页,共64页，2024年2月25日，星期天特点：不对称转录--我们将用作RNA合成的模板的链叫做反义链；另一条不做模板的链叫有义链。RNA为全保留转录转录开始不需要引物，链的延长方向也是5′→3′RNA聚合酶对利福平敏感2.转录的方式一.概论第3页,共64页，2024年2月25日，星期天2.转录的方式一.概论第4页,共64页，2024年2月25日，星期天2.转录的方式对于整个DNA双链，每条链上有的区段用作有义链，有的区段用作反义链。所以，具有相对意义。一.概论第5页,共64页，2024年2月25日，星期天1.转录的酶亚基组成：a2bb'ws=a2bb'w+s

全酶核心酶

——RNA聚合酶

a亚基——解开前方的DNA双螺旋、恢复后面的DNA双螺旋b亚基——催化磷酸二酯键的形成b'亚基——与DNA的非模板链结合

二.原核生物转录第6页,共64页，2024年2月25日，星期天亚基组成：a2bb'ws=a2bb'w+s

全酶核心酶

核心酶：解开前方的DNA双螺旋、RNA链的延伸、恢复后面的DNA双螺旋s亚基：识别DNA上转录的起始部位，从而引导全酶结合上去此外，每个RNA聚合酶还含有2个Zn离子。1.转录的酶二.原核生物转录第7页,共64页，2024年2月25日，星期天

DNA上存在着转录的起始信号，它是特殊的核苷酸序列，称为启动子（promoter）。转录是由RNA聚合酶全酶结合于启动子而被启动的。

2.转录过程-转录启动二.原核生物转录第8页,共64页，2024年2月25日，星期天ThenucleotidesequencesofrepresentativeE.colipromoters

2.转录过程-转录启动二.原核生物转录第9页,共64页，2024年2月25日，星期天

聚合酶全酶上的s因子能识别启动子，并识别有义链，从而使全酶定位到启动子部位。二.原核生物转录2.转录过程-转录启动第10页,共64页，2024年2月25日，星期天第11页,共64页，2024年2月25日，星期天

如何确定启动子部位？DNAFoot-printing第12页,共64页，2024年2月25日，星期天

由全酶在启动子附近将DNA局部解链，约解开17个碱基对。（酶与启动子结合的部位是AT富集区，有利于解链）

第一个核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)结合到全酶上，形成“启动子-全酶-核苷三磷酸”三元起始复合物。

第二个核苷酸参入，连结到第一个核苷酸的3'羟基上，形成了第一个磷酸二酯键。s因子从全酶上掉下，又去结合其它的核心酶。

二.原核生物转录2.转录过程-转录启动第13页,共64页，2024年2月25日，星期天

当s因子从核心酶上脱落后，核心酶与DNA链的结合变得疏松(依靠其蛋白质的碱性与酸性核酸之间的非特异性的静电引力)，可以在模板链上滑动，方向为DNA模板链的3′→5′，同时将核苷酸逐个加到RNA链的3'-OH端，使RNA链以5′→3′方向延伸。二.原核生物转录2.转录过程-链的延伸第14页,共64页，2024年2月25日，星期天

DNA上的解螺旋区：在RNA链延伸的同时，RNA聚合酶继续解开它前方的DNA双螺旋，暴露出新的模板链，而后面被解开的两条DNA单链又重新形成双螺旋，DNA上的解螺旋区保持约17个碱基对的长度。二.原核生物转录2.转录过程-链的延伸第15页,共64页，2024年2月25日，星期天

RNA-DNA杂交区：刚合成出来的RNA链与解开的DNA模板链之间可形成一小段RNA-DNA杂交区。随着核心酶的移动，RNA链不断地延伸，杂交区也往前延伸，但后面的杂交区随着DNA双螺旋的回复，RNA链逐渐被置换出来，因此，杂交区也保持着固定一小段。二.原核生物转录2.转录过程-链的延伸第16页,共64页，2024年2月25日，星期天

DNA分子上有终止转录的特殊信号，也是特定的核苷酸序列，称为终止子。核心酶能识别终止子，停止转录。

这一过程有时需要一种蛋白质——

因子的帮助（当终止信号较弱时）；有时不需要（当终止信号较强时）。

核心酶释放出RNA，自己也离开DNA。

DNA上的解链区重新形成双螺旋。二.原核生物转录2.转录过程-终止第17页,共64页，2024年2月25日，星期天真核细胞的转录比较复杂。真核基因的顺式作用元件（cis-actingelement），即DNA上对基因表达有调节活性的特定序列，按其功能可分为启动子、增强子（enhancer）和沉默子（silencer）等。真核生物的转录，是由RNA聚合酶与这些元件相互作用，在蛋白质辅助因子ρ的协同下完成的。三.真核生物转录1.真核细胞的聚合酶第18页,共64页，2024年2月25日，星期天三.真核生物转录1.真核细胞的聚合酶第19页,共64页，2024年2月25日，星期天

真核细胞启动子是指通用(基础)转录因子和RNA聚合酶II通过相互作用，组装转录起始复合体的位点。三.真核生物转录2.真核细胞的启动子

第20页,共64页，2024年2月25日，星期天三.真核生物转录2.真核细胞的启动子

第21页,共64页，2024年2月25日，星期天第22页,共64页，2024年2月25日，星期天真核生物启动子的多元性

启动子包括

TATA序列(TATAbox)：-25-35TATAbox的作用：使转录精确地起始；启动子是指确保转录精确而有效地起始的DNA序列；TATA序列也叫核心启动元件(corepromoterelement)第23页,共64页，2024年2月25日，星期天(GCbox)GCCACACCC或GGGCGGG序：-80-110;GC区主要控制转录起始频率。CCAAT序列(CAATbox)：-70-80CAAT区主要控制转录起始频率。第24页,共64页，2024年2月25日，星期天第25页,共64页，2024年2月25日，星期天

增强子、及其对转录的影响

a增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列；

b增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍；

c增强效应与其位子和取向无关；三.真核生物转录3.真核细胞的增强子

第26页,共64页，2024年2月25日，星期天d大多为重复序列，一般长度为50bp，其内部常含有一个核心序列(G)TGGA/TA/TA/T(G)；e增强效应有严密的组织和细胞特异性；f没有基因专一性；g许多增强子还受外部信号的调控。第27页,共64页，2024年2月25日，星期天

Enhancer的结构与功能

双方向性，组织特异性，位点非专一性

----Enhancer由两个以上的增强子成分(EnhancerElement)组成

----EnhancerElement必需由两个紧密相连,具有间距效应的

增强子元(Enhanson）组成

----各个Enhanson(cis-factor)与激活蛋白(trans-factor)结合

增强特异性转录

第28页,共64页，2024年2月25日，星期天

En.Elem.En.ElemEn.Elem.-250-180

coreCTCIITCIsphIIsphI

Ap3Ap2Ap1e.g.SV40Enhancer(-179~-250)

远距离控制，无方向性

mRNA

+1GCCAATTATA

促进转录复合体基本转录复合体第29页,共64页，2024年2月25日，星期天RNAinterference(RNAi)representsamechanisminventedbynaturetoprotectthegenome.Inthepastfewyearsthefieldhasemergedatasurprisinglyhighpace.

ThewholestorystartedwhenFireetal.(1998)identifieddoublestrandedRNA(dsRNA)asthemediatorofgenesilencinginC.elegansandreferredtothetermRNAi.三.真核生物转录4.基因沉默-iRNA

WhatisRNAinterference(RNAi)第30页,共64页，2024年2月25日，星期天TheunderlyingmolecularmechanismofgenesilencingprovidesuswithshortinterferingRNAs(siRNAs)whichallowstotargetanygenewithhighspecificityandefficiency.WhatisRNAinterference(RNAi)第31页,共64页，2024年2月25日，星期天Whatistheoutcome,indeed?Introductionintocellsofadouble-strandedRNAcorrespondingtoanexpressedgeneleadstodown-regulationofthatgenethroughdegradationofitsmRNA第32页,共64页，2024年2月25日，星期天HowdoesthesiRNAwork?Introductionofsyntheticsmalldouble-strandoligonucleotide(21-23ntlength)correspondingtospecificgeneintocellwillspecificallyknockdowncorrespondingmRNAinthecell第33页,共64页，2024年2月25日，星期天Anenzymecomplex(Dicer),wasdiscoveredinDrosophila(Bernsteinetal.,2001)aspartofaconservedDicerfamilyexpressedinorganismsundergoingRNAi.DicercontainsdomainsfordsRNAbinding,RNAunwinding,andribonucleaseactivity,andisassociatedwithadditionalproteinstodrivethecleavageofdsRNAinanATPdependentmanner.TheresultingsiRNAaspartofamultiproteinRNA-inducingsilencingcomplex(RISC)istargetedtothecomplementaryRNAspecieswhichisthencleaved.第34页,共64页，2024年2月25日，星期天siRNA:SmallinterferingRNA第35页,共64页，2024年2月25日，星期天第36页,共64页，2024年2月25日，星期天真核基因转录的蛋白因子为蛋白质编码的基因的准确转录受多种转录因子的调控。RNA聚合酶必须在特定的转录因子的参与下才能起始转录。至今有20种以上蛋白因子参与转录起始，可分为三类：通用(基础)转录因子(basaltranscriptionalactivity)：

包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、TFIIJ等。这些蛋白因子对于准确转录起始是必需的。三.真核生物转录5.转录因子

第37页,共64页，2024年2月25日，星期天2.启动子特异性转录激活蛋白(promoter-specifictranscriptionalactivators)它们通过与启动了附近或远离启动子的DNA分子上调控区(增强子)相结合，作用于转录起始复合体组装过程，具有DNA结合域和激活转录所需要的激活结构域。第38页,共64页，2024年2月25日，星期天一般情况，细胞中通用转录因子的种类同基因转录的调控蛋白因子(包括转录激活蛋白、辅助激活蛋白、负调控蛋白因子等)相比，数量较少，但在细胞中的含量是丰富的；这些通用转录因子在启动子区同RNA聚合酶一起组装成转录起始复合物;第39页,共64页，2024年2月25日，星期天特异性调控蛋白因子种类繁多，但含量即非常之少，它们通过其DNA结合域识别特定的DNA序列，这种特性决定了特异性开或关。第40页,共64页，2024年2月25日，星期天

SpecificTrans-factorcharacteristics

l

多为变构蛋白，具有两个功能结构域（domain）DNA-bindingdomainactivationdomainDNA-bindingdomainDimerizationdomain(insomedimerfactor)activationdomain第41页,共64页，2024年2月25日，星期天

Transcriptionactivationdomainhaveaveryhighproportionofacidicaminoacid(alsocalledacidicdomainoracidblobsornegativenoodles)

Trans-factor的活性调节受到严格的信号因子的调控signal一般状态（无活性）bindingDNA

变构活化状态激活转录第42页,共64页，2024年2月25日，星期天几种常见的DNA结合蛋白的结构第43页,共64页，2024年2月25日，星期天Helix-turn-helixmotif第44页,共64页，2024年2月25日，星期天Helix-turn-helixdomainandbindingwithDNA第45页,共64页，2024年2月25日，星期天亮氨酸“拉链”式二聚体亮氨酸“拉链”(leucinezipper)指调控蛋白中发现的一段富含亮氨酸序列，这个区域易于形成两性-螺旋或卷曲螺旋构象，这些蛋白能形成稳定的二聚体。转录因子在模板DNA上形成同源(或异源)二聚体的能力决定了基因表达。第46页,共64页，2024年2月25日，星期天亮氨酸“拉链”式二聚体在“拉链”式蛋白中，“拉链”区以外的氨基酸在都呈碱性，具有结合DNA的本领，“拉链”的吻合有利于形成平行的二重DNA结合区。第47页,共64页，2024年2月25日，星期天Monomeric&dimericstructureofLuczipperLuczipperdimerization第48页,共64页，2024年2月25日，星期天Zincfingerregion一对组氨酸残基TFIIIA蛋白具有9个相似的重复单位每个单位大约由30个氨基酸残基组成一对半胱氨酸zinc

Zincfingerregion第49页,共64页，2024年2月25日，星期天Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His单个锌指的保守区序列第50页,共64页，2024年2月25日，星期天典型真核基因转录调控示意图通用转录因与RNA聚合酶II在启动处组装成转录起始复合体;不同的基因调控蛋白结合到各自的基因调控序列上;转录起始速率是由调控蛋白与通用转录起始复合体相互作用而得以调整.第51页,共64页，2024年2月25日，星期天基因调控序列—启动子—调控蛋白的spatial关系A.结合于增强子处的调控蛋白NtrC与细菌RNA聚合酶的相互作用B.为A的电镜图谱第52页,共64页，2024年2月25日，星期天真核基因转录的综合调控第53页,共64页，2024年2月25日，星期天四.转录后加工1.mRNA加工-帽子结构

第54页,共64页，2024年2月25日，星期天第55页,共64页，2024年2月25日，星期天

有利于核糖体对mRNA的识别，Cap0是必需的，而Cap1和Cap2并非需要的；增加mRNA的稳定性，避免核酸