植物病毒专题知识专家讲座

第四章植物病毒

植物病毒专题知识专家讲座第1页植物病毒概述病毒(virus)是一个由核酸、蛋白或其复合体组成，能够增殖、传染和寄生在其它生物体上非细胞形态分子生物病毒区分于其它生物主要特征是：

1.病毒是个体微小分子寄生物，其结构简单；

2.专性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和场所。按寄主性质不一样，病毒分为寄生植物植物病毒(Plantvirus)、寄生动物动物病毒以及寄生细菌噬菌体等。植物病毒专题知识专家讲座第2页植物病毒危害及作用病毒引发病害在数量上占植物病害第二位。由植物病毒引发植物病害植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫芦科等。在鲁西北引发毁灭性植物病毒病有番茄蕨叶病毒病，花叶病毒病，辣椒花叶病毒病和烟草脉坏死病毒病等。生产上危害较大植物病毒病害有：烟草花叶病、黄瓜花叶病、马铃薯病毒病、玉米矮花叶病等。植物病毒也有可利用价值，尤其在开发基因工程载体、转基因植物研究等方面，发挥了很大作用。植物病毒专题知识专家讲座第3页植物病毒学研究历史1886年梅耶尔(Mayer)证实了烟草花叶病害摩擦传染性;1892年伊凡诺夫斯基(Ivanowski)发觉了烟草花叶病病原能够经过细菌过滤器；1898年伯吉林克(Beijeincku)又发觉该病原不是微生物，而是一个传染性活液(contagiumvivumfluidum)，这就是Virus一词起源；1935年，美国科学家斯坦利（Stanley）取得了烟草花叶病毒蛋白结晶,认为病毒是可在活细胞内增殖蛋白（1946年获NobelPrizeinChemistry)。植物病毒专题知识专家讲座第4页植物病毒学研究历史1936年英国科学家鲍登(Bawden)证实提纯TMV中含有核酸；l939年Kausch经过电子显微镜观察到植物病毒形态；1956年Gierrer证实去掉蛋白质RNA起主要侵染和增殖作用；1971年Diener发觉了很小RNA（250-400bps)称为类病毒（viroid);1982年发觉仅有蛋白质朊病毒

植物病毒专题知识专家讲座第5页植物病毒学研究历史1981年，A.Lwoff在巴黎举行第五届病毒学大会上，这一法国病毒研究所所长阿尔．沃夫，认为病毒不是生物，他观点以下：

生长和分裂独立进化独立生命体原生生物＋＋＋细胞＋－－线粒体和叶绿体＋－－膜＋－－染色体、原质体含核酸－－－病毒－－－总而言之，认为病毒是有机物，而不是生物。植物病毒专题知识专家讲座第6页第一节植物病毒形态、结构与组分植物病毒专题知识专家讲座第7页一、植物病毒形态观察需要电子显微镜，度量尺度为纳米(nm)。植物病毒基本形态为球状、杆状和线条状。球状病毒直径大多在20一35nm，少数能够到达70-80nm，球状病毒也称为多面体病毒或二十面体(icosahedralparticle)病毒。杆状病毒多为20-80nm×100-250nm，两端平齐；少数两端钝圆，线状病毒多为11—13nm×750nm，个别能够到达nm以上。还有少数病毒与以上形态不一样，它们有看上去是两个球状病毒联合在一起，被称为双联病毒(或双生病毒)；有像弹头，被称为弹状病毒；还有呈丝线状，柔软不定形。植物病毒专题知识专家讲座第8页二、植物病毒结构中间核酸，外为蛋白质衣壳，由许多蛋白质亚基组成，核酸和蛋白质亚基均呈螺旋状排列。杆状或条状病毒粒体是空心。

TMV为棒状，CMV球状。球状病毒：20面体，蛋白质亚基为60个或60倍数，蛋白质亚基在每个面上不呈螺旋状排列，镶嵌在表面，粒体中心也是空。核酸链排列还不清楚。

植物病毒专题知识专家讲座第9页三、植物病毒组分植物病毒主要成份是核酸和蛋白质，核酸在内部，外部由蛋白质包被，称为外壳，有病毒粒体中还含有少许糖蛋白或脂类。组成病毒成份：核酸5-40%，蛋白质60-95%，还有水分和矿物质等。

类病毒和拟病毒无蛋白衣壳，无专化性血清学反应，真病毒有专化性血清反应。植物病毒专题知识专家讲座第10页（一）蛋白质

普通植物病毒RNA基因组翻译产物只有4~7种，最多12种，这些产物包含病毒衣壳蛋白，复制酶，运动蛋白、传输辅助蛋白、蛋白酶等。蛋白多肽链经过三维折叠形成衣壳基本结构单位，称为蛋白质亚基，进而形成壳基。壳基是一个形态单位，主要表现在球形病毒上，多数壳基形成衣壳。植物病毒衣壳蛋白含有良好抗原特征，能刺激动物产生抗体，并和抗原发生反应，是血清学方法判定病毒依据。植物病毒专题知识专家讲座第11页（二）核酸核酸是病毒关键，组成了病毒遗传信息库-基因组决定病毒增殖、遗传、变异、和致病性1.植物病毒核酸类型（1）正单链RNA（+ssRNA).其单链RNA能够直接翻译蛋白质，起mRNA作用TMV、PVX、PVY（2）负单链RNA病毒（-ssRNA）。不能起RNA作用，必须先转录成互补链。WRDV（3）双链RNA(dsRNA)MRDV(4)单链DNA（ssRNA）单链先合成双链，以常规路径转录mRNA(5)双链DNA（dsDNA）CaMV花椰菜病毒植物病毒专题知识专家讲座第12页2.病毒核酸百分比球形病毒核酸含量高，占粒体重量15%-45%，长条形病毒中占5%-6%；而在弹状病毒中只占1%3.核酸多分表达象多分表达象为植物病毒所特有，并仅存于正单链RNA中，核酸多分表达象是指病毒基因组分布在不一样核酸链上，分别包装不一样病毒粒体中。所以单个病毒粒体不能完成侵染。这种分段基因组称多组分基因组；含多组分基因组病毒称多分体病毒。正单链RNA病毒依据基因组分离和侵染必须情况又分为单分体病毒TMV、PVX、PVY双分体病毒：烟草脆裂病毒和蠕传病毒三分体病毒：CMV，有四条核酸链，但包被在三个或四个病毒粒体中。植物病毒专题知识专家讲座第13页4.卫星RNA

在一些多分体病毒中发觉了小分量RNA其与病毒RNA无同源性，单独不含有侵染性，要依赖病毒核酸才能侵染和增殖这种核酸称为卫星RNA（sRNA）,其依赖病毒称为辅助病毒；它们包被在同一衣壳内，并抑制辅助病毒复制，降低其浓度，并改变其致病力，可利用生物防治及基因工程抗病育种。植物病毒专题知识专家讲座第14页（三）其它组分水分、糖蛋白或脂类、精胺和亚精胺金属离子植物病毒专题知识专家讲座第15页第二节植物病毒复制和增殖

DNA---RNA---蛋白质，按中心法则进行，因为病毒结构简单，所以，增殖不一样于普通细胞。主要是进行复制，转录和翻译。遗传：病毒侵入后，蛋白质衣壳和核酸分开，核酸利用寄主细胞物质和能量合成负模板，再利用负模板拷贝出大量DNA，再转录成mRNA，再翻译成蛋白质衣壳，最终组装成病毒粒子。

变异：病毒每个变异类群称为一个株系，是病毒种以下分类单位。自然界中病毒株系有自然发生突变和人工诱变两类，Ｘ射线，Υ射线，高温，亚硝酸等均可引发变异。

植物病毒专题知识专家讲座第16页第三节、植物病毒病症状特点

一、外部症状(Symptom)：病毒病害在症状表现上多为系统发病，表现为变色、畸形少数引发坏死、腐烂，萎蔫极少发生。变色：花叶(mosaic)，黄化(yellow)。坏死(negrosis)：也称作枯斑反应，如TMV侵染心叶烟表现为坏死枯斑，马铃薯Ｙ病毒一些株系侵染烟草可产生脉坏死。畸形：抑制型：矮化(dwarf)，卷叶(leafroll)，皱叶(rugose)，蕨叶(fernleaf)。刺激型：丛生(rosette)，肿瘤(tumor)。植物病毒专题知识专家讲座第17页第三节植物病毒病症状特点

二、病组织内部和细胞改变：

1.组织改变：组织坏死：如烟草花叶病毒TMV，它侵染心叶烟引发薄壁组织坏死，有些引发茎部维管束和叶部坏死，烟草花叶病毒侵染大豆引发顶芽和侧枝坏死。普通引发黄化类型病毒病多是因输导组织、韧皮部坏死引发。组织增生：病毒侵染后，寄主植物体内代谢失调，产生激素，引发增生。

植物病毒专题知识专家讲座第18页第三节.植物病毒病症状特点

2.细胞改变：花叶和斑驳是因为细胞内叶绿素遭到破坏所致。内含体(inclussion)：一些植物被病毒侵染后，在病组织中产生一个特殊结构，存在于细胞质或细胞核中，在显微镜下能够观察到。分为不定型内含体Ｘ－体和结晶体。结晶体：有六角型、长条型、正四面体型等，个别还有皿状，无色透明，主要是由病毒粒体和寄主蛋白质有规则地排列形成。

植物病毒专题知识专家讲座第19页第三节植物病毒病症状特点

Ｘ－体：无一定形状，半透明，通常外有一层膜，也是由病毒粒体和寄主物质组成。内含体作用：①植物患病毒病后才有，所以，可作为一个诊疗指标。②但并不是全部病毒病都有内含体，有些必须发育到一定阶段才形成，同时一个病毒还可有各种形态内含体，所以，单靠内含体诊疗还有一定不足。

植物病毒专题知识专家讲座第20页第三节植物病毒病症状特点

三、患病植物生理改变：表现为：①病毒侵染后呼吸强度先上升，后下降。②碳水化合物含量下降。③淀粉在叶部积累引发黄化。④多酚氧化酶和细胞色素氧化酶活性增强，使植物细胞中毒坏死。⑤光合作用下降，破坏了寄主叶绿素。

⑥植物内源激素水平失去平衡，造成畸形。

植物病毒专题知识专家讲座第21页第三节植物病毒病症状特点

四.症状改变：一个病毒引发症状可因病毒、寄主和环境三方面原因而改变。1.病毒本身：①病毒株系(Strain)：同一个病毒在致病性上也有差异，也称为病毒生理小种，为了便于与真菌生理小种区分，称为株系。有强株系(症状表现显著，危害较大)和弱株系(症状不太显著)。如：TMV(弱株系)番茄花叶或斑驳

TMV番茄条斑株系(强株系)坏死，条斑

TMV弱株系侵染烟草引发轻微斑驳，强株系则引发严重花叶。

植物病毒专题知识专家讲座第22页第三节植物病毒病症状特点

②交互保护作用(crossprotection)：同一个病毒弱株系先接种植物后，就能够保护寄主免受病毒强株系严重伤害，即先侵染病毒能够保护植物不再受亲缘关系较近另一个病毒侵染。

假如两种病毒无亲缘关系则没有这种保护作用。

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③拮抗作用和协生作用：拮抗作用：一个病毒侵染寄主植物后，可抑制另一个病毒再对植物侵染。如烟草蚀纹病毒可抑制天仙子花叶病毒和马铃薯Ｙ病毒对烟草侵染。协生作用：两种病毒侵染一个寄主植物后，可使症状比单独侵染时更为严重，加剧为害。如：番茄花叶病毒轻微斑驳>番茄坏死

马铃薯Ｘ病毒

轻微斑驳

植物病毒专题知识专家讲座第24页第三节植物病毒病症状特点

2.寄主原因：①一个病毒在不一样寄主上可表现不一样症状。如：TMV普通烟──全株型花叶症状心叶烟──局部性坏死枯斑②潜伏侵染：一个病毒感染一些植物后，能够侵染但不表现症状现象。如：小麦黄矮病毒在除小麦之外禾本科作物上不表现症状。③同一个病毒侵染同种寄主不一样品种上表现不一样：

a.抗病品种：产生局部枯斑反应。TMV──心叶烟。

b.高抗或免疫品种：病毒侵入后增殖量极少或不能增殖。

c.耐病品种：侵染寄主后可大量繁殖，但表现症状很轻微，这与真菌耐病性不一样。

植物病毒专题知识专家讲座第25页第三节植物病毒病症状特点

3.环境原因：环境原因可抑制或改变症状表现。（1）温度：〉35℃或〈10℃病害症状轻微，尤其是对于花叶病，如油菜花叶病和TMV。隐症：已经表现病毒病症状植株，因为环境条件改变，症状消失现象。这种隐症在条件适当时又可重新表现症状。隐症：条件不一样。潜伏侵染：寄主不一样。

（2）光照：过强、过弱都会影响症状表现。多数在光弱时花叶病症状轻易表现，接种易成功。

植物病毒专题知识专家讲座第26页第四节植物病毒传输和移动一、定义及普通特征植物病毒从一植株转移或扩散到其它植物过程称为传输，而从植物一个局部到另一局部过程称为移动。依据自然传输方式不一样，能够分为介体传输和非介体传输两类。介体传输：是指病毒依附在其它生物体上，借它生物体活动而进行传输及侵染。包含动物介体和植物介体两类。非介体传输：在病毒传递中没有其它它机体介入传输方式，包含汁液接触传输、嫁接传输和花粉传输。病毒随种子和无性繁殖材料传带而扩大分布情况则是—种非介体传输。传输试验是判定病毒必要伎俩，因为要证实一个病害确由某种病毒引发或某种病毒确实存在，即证实侵染性，须使健株感染病毒，同时，了解病毒传输规律也是病害防治基础。植物病毒专题知识专家讲座第27页一、植物病毒有效传输近距离主要靠活体接触摩擦而传输，远距离则依靠寄主繁殖材料和传毒介体传带。不少病毒只有一个常规传输方式，但许多病毒则不止一个方式，而且任何一个均可能在流行中起主要作用，所以对传输方式了解是植物病毒学基础性工作。植物病毒专题知识专家讲座第28页二、介体传输

植物病毒介体种类很多，主要有昆虫、螨类、线虫、真菌、菟丝子等。其中以昆虫最为主要。日前已知昆虫介体约有400各种，其中约200种属于蚜虫类，130各种属于叶蝉类。在传毒介体中，昆虫是最主要介体，其中70%为同翅日蚜虫、叶蝉和飞虱，而又以蚜虫为最主要介体，大部分昆虫传毒资料起源于蚜虫传毒。植物病毒专题知识专家讲座第29页介体与所传病毒之间关系主要依据病毒是否在虫体内循环、是否增殖以及介体持毒时间长短来划分。病毒经口针、消化道进入血液循环后抵达唾液腺，再经口针传输过程称为循回，这种病毒与介体关系称为循回型关系(circulative)，其中病毒叫做循回型病毒，介体叫做循回型介体。循回型相互关系中又依据病毒是否在介体内增殖而分为增殖型(propagative)和非增殖型(nonpropagative)。病毒不在介体体内循环相互关系称为非循回型(nonc比ulative)。依据介体持毒时间长短能够分为非持久性(nonpersistent)、半持久性(semipersistent)和持久性(persistent)三种相互关系。非循回型关系全是非持久性。而循回型关系中又深入分为半持久性和持久性两种。植物病毒专题知识专家讲座第30页植物病毒专题知识专家讲座第31页3．介体与病毒专化性识别可能机制蚜虫试探(probe)取食习性：蚜虫对寄主或非寄主都有先从表面少许取食尝试特征，如适当再刺入输导组织取食。在试探取食过程中即可完成对非持久性病毒获毒或传输，所以能高效传输各种病毒，饥饿时促使试探频率增加故能提升传毒效率。介体内专化性持毒位点：在介体消化道内有一定持毒位点与所传病毒有专化关系。如一些非持久性、半持久性病毒在前消化道中有持毒点，因前消化道也伴随昆虫蜕皮而更新，故蜕皮后不能传毒；蚜虫口针中持毒位点已经得到免疫荧光标识证实辅助因子(Helpercomponent,简称HC)在蚜虫传输非持久病毒寄主细胞中，发觉有一个由病毒编码蛋白与传毒相关，如除去它，蚜虫也就失去传毒能力。这种辅助因子也被称为蚜传因子，最早在马铃薯Y病毒侵染植物中发觉，但辅助因子作用方式还未明确。植物病毒专题知识专家讲座第32页(二)昆虫介体

1．蚜虫在蚜虫介体中，大约有200种蚜虫可传输160各种植物病毒，有蚜虫只传输2—3种病毒，有能够传输40一50种病毒(如蚕豆蚜和马铃薯蚜)，桃蚜甚至能够传输100种以上病毒。在这160各种植物病毒中，有只由一个蚜虫传输，有可由各种蚜虫传输，黄瓜花叶病毒甚至能够由75种蚜虫传输。蚜虫传输植物病毒主要是非持久性关系,包含马铃营Y病毒属、花椰菜花叶病毒属、黄瓜花叶病毒属、苜蓿花叶病毒属等病毒。这些病毒也都很轻易用汁液摩擦方法进行传输。非持久性病毒基本上是存在于薄壁细胞中，尤其是表皮细胞、表皮细胞和栅状组织细胞内，极少含在韧皮组织内。植物病毒专题知识专家讲座第33页

2．叶蝉和飞虱在叶蝉(1eafhopper)亚目(Cicadellidae)大约个属15000种叶蝉中，只有21个属中49种是病毒传输介体。飞虱即使有20个科，但仅仅飞虱亚目(Delphacidae)中含有植物病毒介体。介体寄主主要是禾本科植物，主要作物病害如水稻矮缩病、小麦丛矮病和玉米粗缩病等。叶蝉和飞虱(Planthopper)传输绝大多数病毒属于增殖型，包含植物弹状病毒抖、植物呼肠孤病毒科、细小病毒属和玉米细条病毒属。叶蝉和飞虱传输植物病毒有相同机制，它们不能传输非持久性病毒，少数传输半持久性病毒，如水稻东格鲁病毒。非增殖传输病毒较少，主要是叶蝉传输几个双联病毒。其它昆虫介体还有刺吸式口器白粉虱、粉阶，刮吸式口器蓟马、咀嚼式口器甲虫、蚱蜢等等。植物病毒专题知识专家讲座第34页(三)土壤中介体病毒土传是一个历史提法，现已明确除了TMV可在土壤中存活较久外，土壤本身并不传毒，主要是土壤中线虫或真菌传输病毒。已经知道5个属38个种线虫传输80种植物病毒或其不一样株系，其中多数属于蠕传病毒属和烟草脆裂病毒属病毒，少数为因为线虫在土壤中移动很慢，传输距离很有限，每年仅仅30一50cm。所以这些病毒远距离传输主要依靠苗木其它球状病毒。其中大多数还能够经过感病野生杂草带毒种子传输。

传毒真菌主要是壶菌目和根肿菌目真菌，其中油壶菌属(Olpidium)、多粘菌属(Polymyxa)、粉痂菌属(Spongospora)中5个种能传输20各种病毒。植物病毒专题知识专家讲座第35页三、非介体传输

(一)机械传输机械传输(Mechanicaltransmission)也称为汁液摩擦传输。田间接触或室内摩擦接种均可称为机械传输。田间主要为植株间接触、农事操作、农机具及修剪工具污染、人和动物活动等造成。机械传输对一些病毒很主要，如烟草花叶病毒属(Tobamovirus)和马铃薯X病毒属(Potexvirus)只有此种传输方式；如蠕传病毒属(Nepovirus)常经果树修剪传输；有些病毒在一些特殊种植条件下主要，如黄瓜花叶病毒(CMV)在温室或大棚蔬菜、花卉中易接触传输。这类病毒特点是病毒存在于表皮细胞、浓度高、稳定性强，引发花叶型症状病毒或由蚜虫、线虫传输病毒较易机械传输，而引发黄化型症状病毒和存在于韧皮部病毒难以或不能机械传输。植物病毒专题知识专家讲座第36页(二)无性繁殖材料和嫁接传输因为病毒系统侵染特点，在植物体内除生长点外各部位均可带毒，在以球茎、块根、接穗芽为繁殖作物中尤其主要，如马铃薯、大蒜、郁金香、苹果树等，如母株受侵染则无一幸免。这些无性繁殖材料都能够带毒，故成为主要检疫对象。嫁接是园艺上非常普通农事办法之一，也是证实疑难病原物侵染性主要方法之一。嫁接能够传输任何种类病毒、植物菌原体和类病毒病害。植物病毒专题知识专家讲座第37页(三)种子和花粉传输约1／5病毒能够种传。种子带毒危害主要表现在早期侵染和远距离传输。带毒种子随种子调运会远距离运输传输，是检疫主要对象，如烟草环斑病毒(TRSV)、菜豆普通花叶病毒(BCMV)均可在豆科种子中存活5年以上。种子还可能成为病毒越冬场所，如CMV可在各种杂草种子中越冬。

种传病毒寄主以豆科、葫芦科、菊科植物为多，而茄科植物却极少。病毒种传主要特点是：母株早期受侵染，病毒才能侵染花器；病毒进入种胚才能产生带毒种子，而仅种皮或胚乳带毒常不能种传。种子带毒百分比差异很大，如大麦条纹花叶病毒(BSMV)可达90％一100%；黄瓜花叶病毒(CMV)可达1％一50％，一殷不会很高；种传病毒大多能够机械传，症状常为花叶；如可蚜虫传则为非持久件。伴随种子逐步成熟，其种子带毒率逐步降低；刚采收种子带毒率高，经过贮存而逐步降低。植物病毒专题知识专家讲座第38页四、病毒在植物体内移动植物病毒本身不含有主动转移能力，病毒移动都是被动。病毒在细胞间移动胞间联丝是植物细胞间物质运输通道。病毒长距离移动大部分植物病毒长距离移动是经过植物韧皮部(phloem)，而甲虫传输病毒能够在木质部(xylem)移动。在植物输导组织中，病毒移动主流方向是与营养主流方向一致，也能够随营养进行上、下双向转移。

TMV在叶片和植株内转移过程，病毒接种在番茄中部复叶尖端小叶侧面，经过1~3天，病毒分布到整个小叶；经过3~5天病毒则经过叶脉、叶柄及茎部维管束系统抵达根部和顶部；25天左右病毒已经在全株分布。植物病毒专题知识专家讲座第39页五、防治植物病毒病基本标准1.毁灭和降低侵染起源

(1)采取无毒种子和无性繁殖材料。

(2)种苗处理，51-53℃温水中浸10分钟。

(3)根尖或茎尖组织脱毒培养。

2.治虫防病，毁灭传输介体。

3.选育抗病或耐病品种。

4.栽培管理降低人为传输发病，烟草打尖打杈时先打健株，再打病株。

植物病毒专题知识专家讲座第40页第五节植物病毒分类与命名植物病毒分类工作由国际病毒分类委员会(InterrnationalCommitteeonTaxonomyofviruses，ICTV)植物病毒分会负责。伴随病毒学研究水平提升，新病毒属（组）不停增加，尤其是病毒分类标准、指标内容越来越明确且靠近病毒本质。经过20多年不停修改、充实，到1995年，ICTV先后发表《病毒分类与命名》汇报六次，在第六次汇报中，植物病毒与动物病毒和细菌病毒一样实现了按科、属、种分类。近代病毒分类体系趋于将病毒这类非细胞结构分子寄生物列为独立“病毒界”，下分为RNA病毒和DNA病毒两大类。但为方便及习惯，仍按寄主种类分为动物病毒、植物病毒、微生物病毒等实用系统分类。植物病毒专题知识专家讲座第41页一、植物病毒分类

(一)分类依据植物病毒分类依据是病毒最基本、最主要性质；①组成病毒基因组核酸类型(DNA或RNA)；②核酸是单链(singlestrand,ss)还是双链(doublestrand,ds)；②病毒粒体是否存在脂蛋白包膜；④病毒形态；⑤核酸分段情况(即多分表达象)等。依据上述主要特征，将植物病毒分在9个科47个属中（其中有些属、种还未确定），各科(属)名称及其经典种见表4~3，各科(属)形态及核酸类型见图4—3,199。植物病毒专题知识专家讲座第42页病毒类似物在病毒研究过程中，还相继发觉了一些与病毒相同、但个体更小、特征稍有差异病毒类似物。要依赖其它病毒才能存在小病毒或核酸，称为卫星(satellite)，它们依赖病毒称为辅助病毒(heIpervirus)。它们核酸与辅助病毒极少有同源性，且影响辅助病毒增殖；其中本身能编码衣壳蛋白称为卫星病毒，不能编码衣壳蛋白称为卫星核酸。因为植物病毒卫星核酸都是RNA，故称为卫星RNA(satelliteRNA，sRNA)。一些无衣壳蛋白、RNA部分含有双链结构称为类病毒(viroid)；含有线状和环状两种RNA称为拟病毒(virusoid)；没有核酸只有蛋白质侵染因子称为阮病毒(prion)。为了分类上方便，将这些病毒都归入亚病毒(subviruses)，而由核蛋白体组成病毒则称为真病毒(euviruses)。植物病毒专题知识专家讲座第43页(三)病毒株系株系(strain)是病毒种下变种，含有生产上主要性。当分离到一个病毒，但还未完全了解其特征、不能确定分类地位时，常称其为“分离物”或“分离株”(isolate)。植物病毒专题知识专家讲座第44页二、植物病毒命名植物病毒名称当前不采取拉丁文双名法，仍以寄主英文俗名加上症状来命名，如烟草花叶病毒为Tobaccomosaicvirus，缩写为TMV；黄瓜花叶病毒为Cucumbermosaicvirus，缩写为CMV。属名为专用国际名称，常由经典组员寄主名称(英文或拉丁文)缩写十主要特点描述(英文或拉丁文)缩写十virus拼组而成。如：黄瓜花叶病毒属学名为Cucu—mo—virus；烟草花叶病毒属为Toba—mo—virus。即植物病毒属结尾是一virus，科、属名书写时应用斜体，而种和株系书写不采取斜体。类病毒(viroid)在命名时遵照相同于病毒规则，因缩写名易与病毒混同，新命名规则要求类病毒缩写为Vd，如马铃薯纺锤块茎类病毒(Potatospindletuberviroid)缩写为PSTVd。植物病毒专题知识专家讲座第45页第六节植物病毒判定原理植物病毒分类是将已知病毒按一定标淮、相同程度或相关性次序排列，拼成一个系统，即分类系统。植物病毒判定主要目标是确定一个病毒在分类系统中地位，因为植物病毒个体微小，结构简单，对寄主依赖性强，判定工作难度大，技术性强，对工作条件要求高。判定植物病毒过去大多采取病毒间生物学特征差异，如所致症状类型、传输方式、寄主范围等；现在则增加了病毒核酸、蛋白分子生物学、生物化学等方面方法。惯用方法有生物学试验、血清学检测和电子显微镜观察等。植物病毒专题知识专家讲座第46页一、生物学试验生物学试验目标是确定病原侵染性，用试验方法证实病毒与病害直接相关性。生物学试验还能够确定病毒传输方式，明确病毒所致病害症状类型和寄主范围。在分子生物学技术尚欠发展过去，只有生物学方法能够区分在遗传信息上一个核苷酸或者蛋白质中一个氨基酸变异，所以生物学试验是其它试验方法所不可取代。生物学试验中应用最多是判别寄主，即用来判别病毒或其株系含有特定反应植物。凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并含有特征性症状植物都可作为判别寄主。组合使用几个或一套判别寄主称为判别寄主谱。判别寄主谱中普通包含可系统侵柒寄主、局部侵染寄主和不受侵染寄主。如若区分经常出现黄瓜花叶病毒属三个组员，采取表4—4判别寄主。植物病毒专题知识专家讲座第47页

二、电子显微镜技术

与光学显微镜相比，电子显微镜使用光源波长更短(属于短波电子流)，所以分辨率也大大提升(9.9×l0-11m，比光学显微镜高千倍以上)。不过电子束穿透力低，样品厚度必须在10~100nm之间。所以电镜观察需要特殊载网和支持膜，需要复杂制样和切片过程。病毒观察最惯用是负染技术和免疫电镜技术。所谓负染，是指经过重金属盐在样品四面堆积而加强样品外围电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品形态和大小。与超薄切片(正染色)技术相比，负染不但快速简易，而民分辨率高，当前广泛用于生物大分子、细菌、原生动物、亚细胞碎片、分离细胞器、蛋白晶体观察及免疫学和细胞化学研究工作中，尤其是病毒快速判定及其结构研究所必不可少一项技术。植物病毒专题知识专家讲座第48页三、血清学技术

抗血清制备：利用植物病毒衣壳蛋白抗原(antigen)特征，能够制备病毒特异性抗血清(antiserum)。先将纯化植物病毒注射小动物(兔子、小白鼠、鸡等)，一定时间后取血，取得抗血清。血清制备关键是病毒纯化，纯度高病毒才能取得特异性强抗血清。血清反应植物病毒与其血清反应有好各种，但依据原理都是抗原与抗体特异性结合。最惯用两种方法是琼脂双扩散和酶联免疫吸附测定法。植物病毒专题知识专家讲座第49页琼脂双扩散法：在一定浓度琼脂凝胶中，抗体和抗原相互扩散，在适当位置形成沉淀；沉淀线形状说明抗原和抗体相互关系。如图4—12：(1)说明两种抗原相同，都与已知抗血清反应；(2)说明两种抗原有一定亲缘关系，但不完全相同；(3)说明抗血清不专化，含有两种以上抗体。酶联免疫吸附(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)法：该方法利用了酶放大作用，使免疫检测灵敏度大大提升。与其它检测方法相比较，ELISA有突出优点：一是灵敏度高，检测浓度可达1-10ng／m1;二是快速，结果可在几个小时内得到；三专化性强，重复性好；四是检测对象广，可用于粗汁液或提纯液，对完整和降解病毒粒体都可检测，普通不受抗原形态影响；五是适合用于处理大批样品，所用基本仪器简单，试剂价格较低,且可较长久保留。含有自动化及试剂盒发展潜力。ELISA是实现“快速、准确、经济”检测最好伎俩之一〔图4—l3植物病毒专题知识专家讲座第50页

四、核酸杂交及PCR技术

血清学技术利用是病毒衣壳蛋白抗原性，检测目标是蛋白。因为核酸才是有侵染性，仅仅检测到蛋白并不能必定病毒有没有生物活性。所以，核酸检测技术也是判定植物病毒更可靠方法，主要有核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)方法比较惯用。核酸杂交主要在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补DNA之间存在着碱基互补关系。在一定条件下，RNA--DNA形成异质双链过程称为杂交。其中预先分离纯化或合成已知核酸序列片段叫做杂交探针(Probe)，因为大多数植物病毒核酸是RNA，其探针为互补DNA(complementaryDNA，cDNA)，也称为cDNA探针。核酸检测不但能够检测到目标病毒核酸，而且还能够检测出相近病毒(或核酸)间同源程度。植物病毒专题知识专家讲座第51页聚合酶链式反应(PCR)是在短时间内大量扩增核酸有效方法，用于扩增位于两段已知序列之间DNA区段。从已知序列合成两段寡聚核苷酸作为反应引物，它们分别与模板DNA两条链上各一段序列互补且位于待扩增DNA区段两侧。反应时，首先在过量两种引物及4种dNTP参加下对模板DNA进行加热变性。随之将反应混合液冷却至某一温度使引物与其靶序列发生退火。今后退火引物在耐热洲A聚合酶作用下得以延伸。如此重复进行变性、退火和DNA合成这一循环。每完成一个循环，理论上就使目标DNA产物增加1倍，在正常反应条件下，经25—30个循环扩增倍数可达百万。

PCR扩增在检测标本中病原核酸序列、由少许RNA生成cDNA文库、生成大量DNA以进行序列测定、突变分析等方向已经得到广泛应用。植物病毒专题知识专家讲座第52页五、物理化学等特征在植物病毒研究过程中，人们发觉不一样病毒对外界条件稳定性不一样，这便成为区分不一样病毒依据之一。伴随新病毒种类发觉和分子生物学研究深入，人们也逐步认识到这些物理特征在区分不一样病毒中不足。1．稀释限点(DilutionEndPoint，DEP)保持病毒侵染力最高稀释度，用10-1，10-2，10-3……表示，它反应了病毒体外稳定性和侵染能力，也象征着病毒浓度高低。2．钝化温度(ThermalInactivationPoint,TIP)处理十分钟使病毒丧失活性最低温用摄氏温度表示。TIP最低病毒是番茄斑萎病毒，只有有45℃；最高是烟草花叶病毒，为97℃；而大多数植物病毒在55—70℃之间；3．体外存活期(Longevityinvitro，LIV)在室温(20~22℃)下，病毒抽提液保持浸染力最长时间。大多数病毒存活期在数天到数月。植物病毒专题知识专家讲座第53页4．沉降系数及分子量沉降系数S是指一个物质在20℃水中在1达因(1／981g)引力场中沉降速度，单位是每秒若干厘米，因这一单位太大，多采取其千分之一，即Svedberg单位。植物病毒S20ω常在50S到数千S之间。沉降系数测定要用超速分析离心机，依据该病毒在一定离心力下沉降速度来计算。有了沉降系数还能够来计算分子量。

5．光谱吸收特征因为蛋白质和核酸都能吸收紫外线，蛋白质吸收高峰在280nm左右，核酸在260nm左右。所以260／280比值能够表示病毒核酸含量多少，用于区分不一样病毒，比值小多是线条病毒，比值高可能是球状病毒；对同一个纯化病毒，紫外吸收值能够表示病毒浓度，对未纯化病毒其260／280比值偏离标准值情况，说明病毒纯度.文件中常有E0.1%1cm260nm值,表示该病毒在0．1％浓度，光径为1cm比色杯中在260nm处吸收值。

6．植物病毒化学特征主要是指核酸类型、核酸链数以及核酸分子量、核酸在病毒粒体中百分含量等。病毒核酸这些特征用在病毒分科、分属之中。植物病毒专题知识专家讲座第54页

表4-4黄瓜花叶病毒属三种病毒

在判别寄主植物上症状反应

判别寄主 黄瓜花叶病毒 花生矮化病毒番茄不孕病毒

花生无病症褪绿，矮花叶无症状菊花不侵染？侵染黄瓜花叶花叶无花叶 植物病毒专题知识专家讲座第55页

第六节主要植物病毒属及经典种

一、烟草花叶病毒属及TMV二、黄瓜花叶病毒和CMV三、马铃薯Y病毒属及PVY植物病毒专题知识专家讲座第56页一、烟草花叶病毒属及TMV烟草花叶病毒属(Tobamovirus)含有13个种和2个可能种，经典种为烟草花叶病毒(TMV)。病毒形态为直杆状，直径18nm，长300nm烟草花叶病毒属中大多数病毒寄主范围较广，属于世界性分布；自然传输不需要介体生物，靠植株间接触传输；对外界环境抵抗力强。体外存活期普通在几个月以上。在干燥叶片中能够存活50多年；稀释限点为l0-4一10-7，钝化温度90℃左右。引发花叶病是烟草、番茄等作物上主要病害，发生普遍严重。TMV主要靠病汁液接触传输，在农事操作中沾染了病株汁液手或工具经过接触烟苗微伤口侵入。因为病毒抗逆力很强，混有病株残体肥料、种子、土壤和带病其它寄主植物及野生植物，甚至烤过烟叶、烟末都能够成为病害初侵染起源。植物病毒专题知识专家讲座第57页二、黄瓜花叶病毒和CMV黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)有3个组员，即黄瓜花叶病毒(CMV)、