农药的代谢医学宣教专家讲座

代谢研究方法活体研究invivo离体研究

invitro农药的代谢医学宣教专家讲座第1页组织匀浆沉淀（细胞核、组织碎片）滤液

上清液沉淀（叶绿体）上清液沉淀（线粒体）上清液（胞液、核糖体）沉淀（微粒体）100,000~105,000g,1hr9,000~11,000g,30min1,000~3,000g,10min过滤农药的代谢医学宣教专家讲座第2页代谢酶

初级代谢酶水解酶、多功效氧化酶（MFO）次级代谢酶谷光甘肽-s-转移酶（GST）、葡萄糖醛酸转移酶（glucuronyltransferase）、硫酸转移酶（sulphateesterase）、甘氨酸转移酶、葡萄糖转移酶农药的代谢医学宣教专家讲座第3页多功效氧化酶（MFO）RH＋O2

＋[2H]ROH＋H2OMFO是膜结合酶。主要由P450、NADPH-细胞色素还原酶、NADH-细胞色素b5还原酶、磷脂等成份组成。其中细胞色素P450还原形式与CO结合后在450nm附近产生特征吸收峰，故命名为P450。细胞色素P450几乎在全部生物中都存在，包含动物、植物、昆虫、细菌等。农药的代谢医学宣教专家讲座第4页反应机理P450本质上属于血红素－硫铁蛋白（heme-thiolateprotein），上面有底物和氧结合位点。NADPH-细胞色素还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶在酶系中起电子传递作用。农药的代谢医学宣教专家讲座第5页农药的代谢医学宣教专家讲座第6页Thisentirereactioncycleusuallytakesbetween1and10seconds农药的代谢医学宣教专家讲座第7页P450多样性

依据分类命名系统,P450蛋白或基因全序列同源部分>40%为同一家族（family）,用一阿拉伯数字表示；同源性>40%~65%为同一亚族（subfamily）界限，在家族表示式后加一大写英文字母；每一亚族内单个酶则在表示式后再加一阿拉伯数字

农药的代谢医学宣教专家讲座第8页哺乳动物当前已知哺乳动物体内有14个CYP450家族,即CYP1、2、3、4、5、7、8、11、19、21、24、27、51（夏伟，）。其中CYP1～CYP4家族是代谢外来化合物主要酶系,而且各同工酶有其较固定代谢底物、反应类型。CYP1A底物以环境致癌物为主,如多环芳烃、黄曲霉毒素。CYP2E1则主要参加乙醇等小分子化合物代谢,尤其是亚硝胺在体内产生致癌、诱变产物必须经CYP2E1A2羟化作用。大多数临床口服药品在体内代谢酶是CYP3A。农药的代谢医学宣教专家讲座第9页植物植物第一个P450cDNA是CYP71A1,它是由Bozak等（1990）由鳄梨中分离出与成熟相关P450基因。至今已判定了90多个植物P450基因。它们分属于27个家族（CYP51,CYP71,CYP72⋯CYP96)（刘宛等，）农药的代谢医学宣教专家讲座第10页昆虫昆虫第一个P450cDNA是Snyder和Davidson（1983）从果蝇Drosophilamdanogaster中分离，但当初并不知道它是细胞色素P450基因，以后被重新发觉而被定名为CYP4E1。昆虫P450基因总数尚不清楚，至今已判定昆虫P450基因已超出50个，分属6个基因家族(CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP28，CYP18)。其中CYP4，CYP6，CYP9，CYPI2，CYP28等5个基因家族为昆虫所特有（潘贻武等，）。农药的代谢医学宣教专家讲座第11页P450可诱导性P450能够代谢许多亲脂化合物，包含胆固醇、类固醇、激素、维生素D等内源化合物和外源非极性化合物。天然化合物除虫菊素pyrethrins、单萜类monoterpene、黄酮类flavonoid、香豆素coumarins、甾醇、异黄脑素、2－十三烷酮、2－十三烷酮、吲哚－3－甲醇、尼古丁、ß－胡萝卜素、己醇、保幼激素、蜕皮酮、等等。人工化合物苯巴比妥phenobarbital(BP)、3－甲基胆蒽（3－MC）、DDT、环戊二烯类杀虫剂、萘napthaiene、西维因、有机磷化合物（TOCP、TPP、DEF）、丁羟基丁氧化物butylhydroxybutoxide、丁羟基甲苯butylhydroxytoluene、烷基苯alkylbenzenes、polychlorinatedbephenyls（PCBs）、增效醚piperonylbutoxide(PBO)、苯酰苯脲benzoylphenylureas、保幼激素类似物、等等（邱星辉、冷欣夫，1997）农药的代谢医学宣教专家讲座第12页农药的代谢医学宣教专家讲座第13页依据现有资料，细胞色素P450能够被大约200种化合物诱导，能够催化约40种类型化学反应，现有底物约1,000种（邱星辉、冷欣夫，1997）。农药的代谢医学宣教专家讲座第14页MFO参加代谢反应烷基羟化芳基羟化农药的代谢医学宣教专家讲座第15页O－烷基羟基化N－烷基羟基化农药的代谢医学宣教专家讲座第16页环氧化脱S（活化）农药的代谢医学宣教专家讲座第17页S－加氧（活化）农药的代谢医学宣教专家讲座第18页MFO与抗药性关系家蝇CYP6A1能够将艾氏剂和氯丹分别氧化为狄氏剂和环氧化氯丹。重组杆状病毒感染鳞翅目细胞系统中表示CYP6A2除了能够将艾氏剂和氯丹氧化对应环氧化物，还能经过脱硫作用和氧化酯解作用分别将有机磷杀虫剂二嗪磷diazinon代谢为diazoxon和2－异丙基－4甲基－6羟基嘧啶。果蝇CYP4E2基因在DDT抗性品系中高效表示CYP6D1mRNA高效表示与家蝇对二氯苯醚菊酯抗性相关（朱礼华等，）农药的代谢医学宣教专家讲座第19页CYP4mRNA高效表示与淡色库蚊对溴氰菊酯抗性相关（朱昌亮等，）农药的代谢医学宣教专家讲座第20页MFO检测

P450含量测定底物氧化法mRNA含量测定农药的代谢医学宣教专家讲座第21页P450含量测定特征光谱：还原性P450与CO结合后在450nm处有最大吸收峰在加有适量连二亚硫酸钠试管里，加入微粒体悬液，混匀，通CO气体1min，在分光光度计上400~500nm范围进行扫描。计算公式为P450=(A450一A490)／(91×Pr)×1000(nmol／mg蛋白)，其中91为吸光系数，Pr为蛋白质浓度(mg／mL)（严敏芬等，）农药的代谢医学宣教专家讲座第22页底物氧化法7-乙氧基异吩恶唑——7-乙氧基异吩恶唑0-脱乙基酶（EROD）7-乙氧基豆香素——7-乙氧基豆香素0-脱乙基酶（ECOD）苯并芘B[a]P——芳基羟化酶(AHH)艾氏剂

——环氧化酶农药的代谢医学宣教专家讲座第23页芳香基羟基化酶（arylhydroxylase，AHH）刘永杰等（）以苯并芘为底物得抗氯氟氰菊酯甜菜夜蛾品系中肠微粒体AHH比敏感品系高1.51倍农药的代谢医学宣教专家讲座第24页O-烷基羟基化酶用对硝基苯甲醚，又称对硝基茴香醚（p-nitroanisole,PNA）为底物。反应生成对硝基酚在碱性条件下呈黄色，在400nm波长下比色：农药的代谢医学宣教专家讲座第25页N-烷基羟基化酶以对氯-N-甲基苯胺为底物，每5毫升反应体系中加入3μmol。用含6%对二甲基氨基苯甲醛3mol/L硫酸溶液中止反应，在387纳米波长下比色：农药的代谢医学宣教专家讲座第26页环氧化酶用艾氏剂作底物，由气相色谱法检测（刘永杰等，）。农药的代谢医学宣教专家讲座第27页测定MFO较为灵敏方法，是以7-乙氧基异吩恶唑或7-乙氧基豆香素作底物，以荧光法测定酶脱O-烷基（EROD，ECOD）活性。测定EROD活性反应体系中，7-乙氧基异吩恶唑添加量只需要1μmol/L,用对硝基苯甲醚和对氯-N-甲基苯胺作底物时，底物添加量分别需到达800μmol/L和600μmol/L。以荧光法测定EROD活性时，取激发波长537纳米，发射波长为583纳米。EROD农药的代谢医学宣教专家讲座第28页酶源和辅基MFO催化反应需要还原型辅酶II（NADPH）参加可直接使用NADPH，也能够用NADP、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成NADPH生成系统作辅酶。检测MFO催化反应多以微粒体作为酶源农药的代谢医学宣教专家讲座第29页ERODCYP1A1MRODCYP1A2PRODCYP2B1/2B2ethoxyresorufinmethoxyresorufinpentoxyresorufin农药的代谢医学宣教专家讲座第30页酯酶

羧酸酯酶（B-酯酶，EC3.1.1.1）——马拉硫磷农药的代谢医学宣教专家讲座第31页芳基二烷基磷酸酯酶（A-酯酶，EC3.1.8.1，对氧磷酶）农药的代谢医学宣教专家讲座第32页酯酶在害虫有机磷抗性中起着极为主要作用，在对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯抗性中也起一定作用。酯酶在抗性机制中含有两个作用经过水解作用产生无毒代谢产物结合作用杀虫剂，形成磷酰化酶或氨基甲酰化酶，使杀虫剂不能抵达靶标。二者均能起到保护体内靶标－乙酰胆碱酯酶免受抑制。酯酶与抗药性农药的代谢医学宣教专家讲座第33页酯酶参加代谢反应酰胺（水解）酶——乐果农药的代谢医学宣教专家讲座第34页芳基酰胺（水解）酶——敌稗农药的代谢医学宣教专家讲座第35页环杨化物水解酶——西维因农药的代谢医学宣教专家讲座第36页酯酶检测酯酶可水解α-醋酸萘酯为醋酸和α-萘酚。后者与固蓝B盐反应生成一个蓝紫色物质（λ=550～600纳米nm）。酯酶检测也能够用β-醋酸萘酯作底物，产物呈紫红色。pH对显色反应有很大影响。染液中可加入4~5%SDS，一来增色，二来终止反应。农药的代谢医学宣教专家讲座第37页α-和β-醋酸萘酯为非特异性底物，检测昆虫酯酶时，可在反应体系中加入10-7mol/L左右毒扁豆碱，以消除胆碱酯酶活性。毒扁豆碱不能排除其它酯酶，如A-酯酶活性。所幸A-酯酶普通只存在于哺乳动物体内。农药的代谢医学宣教专家讲座第38页谷光甘肽-s-转移酶（GST）依据底物不一样，GST（EC2.5.1.18）又能够分为谷胱甘肽-S-烷基转移酶、谷胱甘肽-S-芳基转移酶和谷胱甘肽-S-环氧化物基转移酶。以还原型glutathione（甘氨酸＋胱氨酸＋谷氨酸）作为辅酶不论哺乳动物动物，还是昆虫体内GST，多以二聚体形式存在。依据等电点不一样，能够分为碱性（α）、中性（μ）、酸性（π）三种类型农药的代谢医学宣教专家讲座第39页GST参加代谢反应西维因carbaryl阿特拉津atrazine农药的代谢医学宣教专家讲座第40页GST参加代谢反应二嗪农diazinon

对氧磷paraoxon农药的代谢医学宣教专家讲座第41页

GST检测——谷胱甘肽-S-烷基转移酶以14C标识碘甲烷为底物，在酶催化下，碘甲烷与谷胱甘肽生成不挥发衍生物，未反应碘甲烷以溴甲醇除去，经过对标识物测定求出酶活性：农药的代谢医学宣教专家讲座第42页GST检测——谷胱甘肽-S-芳基转移酶

以1，2-二氯-4-硝基苯（DCNB）或1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）为底物DCNB或CDNB与还原型谷胱甘肽产生轭合物，在360纳米波长下有最大吸收峰据Fournier（1995）等报道，家蝇体内谷胱甘肽-S-转移酶可分为两种：酶活性最适pH为酸性（6.5）种类对1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）活性高，最适pH为碱性（8.0）种类对1，2-氯-4-硝基苯有较高活性(DCNB)。农药的代谢医学宣教专家讲座第43页葡萄糖醛酸转移酶（glucuronyltransferase）