植物组织培养的基本技术与设施

关于植物组织培养的基本技术与设施

外植体（Explants）：指植物离体培养的各种接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。一、外植体的选择外植体的选择依据优良的种质健壮的植株大小适宜的外植体适宜的发育时期适宜的部位适宜生理状态和发育年龄的器官细胞培养材料的选择第2页,共49页，2024年2月25日，星期天

（二）外植体灭菌的一般步骤

二、外植体的灭菌（一）常用灭菌剂的使用及其效果（三）各种外植体的灭菌方法第3页,共49页，2024年2月25日，星期天（一）常用消毒剂消毒剂使用浓度（％）去除的难易消毒时间（分）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗菌素硝酸银9～102饱和溶液1～210～120.1～170～754～5（mg/L）1易易易易最易较难易中较难5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好较好好自:曹孜义第4页,共49页，2024年2月25日，星期天（二）外植体灭菌的一般步骤3.将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活化剂Tween20或Tween80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须把玻璃瓶摇动2～3次。

4．消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复3～4次。1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌。

2．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。第5页,共49页，2024年2月25日，星期天

1、茎尖、茎段及叶片等的消毒消毒前要经自来水较长时间的冲洗。消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后用2%～10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分钟消毒后，用无菌水冲洗3次后方可接种。2、果实及种子的消毒用自来水冲洗10～20分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠溶液浸10min后，用无菌水冲洗2～3次。种子要先用10%次氯酸钠浸泡20～30min甚至几小时。对难以消毒的还可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒5min。胚或胚乳培养时，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%～10%的次氯酸钠溶液浸泡8～10min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。（三）几种外植体的灭菌方法第6页,共49页，2024年2月25日，星期天

70％酒精擦洗花蕾，或浸泡数秒钟饱和漂白粉上清液：浸泡10分钟；或次氯酸钠液2％～5％：8～10分钟无菌水冲洗几次后，吸去水分，剥取花药或胚珠接种。3、花药的消毒第7页,共49页，2024年2月25日，星期天

预先用自来水洗涤，再用软毛刷刷洗，且用刀切去损伤及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。可采用0.1%～0.2%升汞浸5～10min或2%次氯酸钠溶液浸10～15min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接种。

4、根及地下部器官的消毒第8页,共49页，2024年2月25日，星期天

三、外植体的接种和培养

（一）无菌操作（二）外植体的培养第9页,共49页，2024年2月25日，星期天

植物组织培养的接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作过程，是一种无菌技术。在操作过程中引起的污染来源：主要是由材料本身带菌和工作人员本身引起的。

（一）无菌操作第10页,共49页，2024年2月25日，星期天

污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子每次接种前半小时地面：用70％酒精喷雾使空气的灰尘沉降。紫外线灯照射20分钟。工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗。

1、接种室的消毒第11页,共49页，2024年2月25日，星期天

入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。2、工作人员要求第12页,共49页，2024年2月25日，星期天

切取和接种较大的材料肉眼观察即可操作分离，较小的材料需在双筒解剖镜下操作。分离工具一定要放好，切割动作要快，防止挤压使材料损伤而失败。

接种时要防止交叉污染的发生3、材料的切取第13页,共49页，2024年2月25日，星期天酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧4、接种的具体操作第14页,共49页，2024年2月25日，星期天旋转灼烧取外植体接种盖好瓶塞第15页,共49页，2024年2月25日，星期天

1、培养条件：

温度：常保持在23±2℃，夜温低1—2℃

光照时数：大多数情况下为16h（暗培养不需要光照，例如起始培养的前几天不需要光照）

光照强度：1000—3000lx，白色荧光灯，光的作用是满足形态建成的需要（诱导）

相对湿度：培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当调整培养间湿度（二）外植体培养第16页,共49页，2024年2月25日，星期天

接种后3～7天内，主要是检查其污染情况。增殖、继代培养，建立了无菌培养系。细胞学观察：一般每隔3～5天观察一次。及时记录。观察方法根据培养方式灵活掌握：可用显微镜进行定点观察如平板培养可用倒置显微镜观察如液体培养2、定期检查和细胞学观察第17页,共49页，2024年2月25日，星期天

1．外植体先形成愈伤组织，再分化成完整的植株。四、外植体的成苗途径2．胚状体发生3．外植体经诱导后直接形成根与芽，发育成完整的植株4．原球茎型---图片第18页,共49页，2024年2月25日，星期天石斛兰的原球茎第19页,共49页，2024年2月25日，星期天外植体愈伤组织

根、芽芽根根芽胚状体根、芽试管苗外植体的成苗途径第20页,共49页，2024年2月25日，星期天

不定芽形成---多细胞参与胚状体形成过程--单细胞参与体细胞胚的发育过程第21页,共49页，2024年2月25日，星期天

低CTK/IAA外植体愈伤组织芽根脱分化再分化低CTK/IAA根

完整植株生长调节物质控制器官分化的模式芽高CTK/IAA低CTK/IAA第22页,共49页，2024年2月25日，星期天五、污染的原因及其预防措施

污染

概念：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。原因：细菌菌斑呈黏液状物。除材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染外，操作人员的不慎也是造成细菌污染的重要原因。因此接种人员的手应经常用70％酒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。真菌污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10d才能发现，造成真菌污染的原因多为周围环境的不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养瓶的口径过大、操作不慎等途径：

外植体带菌；培养基及器皿灭菌不彻底；操作人员未遵守操作规程等。第23页,共49页，2024年2月25日，星期天

防止材料带菌的措施

用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。避免阴雨天在田间采取外植体。对于材料内部污染的材料采取特殊方法。

外植体的灭菌

多次灭菌法多种药液交替浸泡法金属器械的灭菌一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在95％的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。金属器械也可以用干热灭菌法灭菌，即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。布质制品的灭菌:工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品，放入高压灭菌器中，在压力为108kPa，温度为121℃的情况下，灭菌20～30min无菌操作室的灭菌:

无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2％的新洁尔灭或70％的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用70％的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。操作人员

污染的预防措施第24页,共49页，2024年2月25日，星期天六、外植体的褐变及其防止措施

（一）褐变的原因

1.基因型

2.外植体的生理状态

3.培养基的成分无机盐浓度；植物生长调节物质；外植体脱分化条件；转移时间过长。

（二）褐变的防止措施

1.选择适宜的外植体2.最佳培养基3.连续转移

4.加抗氧化剂5.活性炭

第25页,共49页，2024年2月25日，星期天七、培养物的玻璃化现象及其预防措施

（一）玻璃化现象叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。第26页,共49页，2024年2月25日，星期天

激素浓度激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高)。琼脂浓度琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重。温度：适宜的温度可以使试管苗生长良好。光照时间多数植物在10～12h光照下都生长良好，大于15h时，玻璃化苗明显增加。通风条件愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。愈伤组织和试管苗长时间培养，不能及时转移，容易出现玻璃化苗。组织培养所用瓶盖棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气较好，玻璃化苗的比例较低。离子水平培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。

（二）产生玻璃化苗的因素第27页,共49页，2024年2月25日，星期天

适当控制培养基中无机营养成分；适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度；适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度；增加自然光照，控制光照时间；控制好温度；改善培养器皿的气体交换状况在培养基中添加其他物质，加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化。如添加马铃薯汁液法可降低油菜玻璃苗的产生频率；0.5mg／L多效唑或10mg／L的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；1.5～2.5g/L的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化。加入0.3％的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率。（三）预防措施第28页,共49页，2024年2月25日，星期天

试管苗的特点试管苗的驯化试管苗的移栽提高试管苗移栽成活率的途径

八、试管苗的驯化与移栽第29页,共49页，2024年2月25日，星期天（一）、试管苗的特点

试管苗的生态环境高温且恒温；高湿；弱光；无菌。试管苗的特点

试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达；试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用较差；试管苗的叶片气孔数目少，活性差；试管苗根的吸收功能弱。

试管苗和普通苗的根解剖比较蓝莓第30页,共49页，2024年2月25日，星期天（二）、试管苗的驯化

驯化的目的:在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。驯化的原则：应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步适应的目的。驯化的方法:炼苗由培养室转移到半遮荫的自然光下锻炼，在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相似。

第31页,共49页，2024年2月25日，星期天

试管苗的驯化第32页,共49页，2024年2月25日，星期天（三）、试管苗的移栽

常规移栽法直接移栽法嫁接移栽法指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。第33页,共49页，2024年2月25日，星期天（四）、提高试管苗移栽成活率的途径

试管苗的生理状况植物生长调节物质无机盐浓度活性炭环境因子移栽过程中试管苗从无菌向有菌逐渐过渡第34页,共49页，2024年2月25日，星期天

1．进行植物组织培养需要哪些设备？各有何作用?2．植物组织培养主要包括哪些环节?各环节的主要工作内容是什么?3．培养基包括哪些基本成分?其作用是什么?如何配制?4．如何对外植体、培养基、培养器皿、接种器械进行灭菌？

5．离体培养的植物材料对光、温、湿度有何要求？如何调控？

6.何谓玻璃化？何谓褐化？如何克服？复习思考题第35页,共49页，2024年2月25日，星期天第二节实验室的设计与设备第36页,共49页，