分生大实验须知(1)课件

分子生物学综合大实验生物化学与分子生物学实验教学中心课程安排时间安排实验题目实验室条件实验室要求报告上交时间绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆

EGFP

Enhanced

Green

Fluorescent

Protein

课程安排1．学生分组（4~5人/小组），选定组长，分配好实验室。GFP实验安排在第1、2、5、6、7、8实验室进行。2．开题，学生仔细查询研读资料，自主设计方案，无需提交报告。3．老师讲解注意事项等之后，学生按分组自主进行实验。4.实验分四部分：质粒提取——PCR——连接、转化——挑菌、提质粒、酶切鉴定5．全部实验结束后，完成报告。6．用学术论文的格式来完成实验报告提交（参考学术杂志）。7．实验报告提交地址：50/rar/实验题目：绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆技术路线：

1.获取EGFP的基因2.克隆EGFP基因（注意：使用T克隆法，不要求表达)重组DNA技术操作过程可形象归纳为分分离目的基因切限制酶切割目的基因与载体接连接重组体转转入受体细胞筛筛选重组体、转化子重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交

以质粒为载体的DNA克隆过程切连转筛PCRT连转筛转表达切连转筛转表达PCR鉴定实验设计流程:实验设计思路分---PCR分离目的基因切接---目的基因与载体相连转---转入宿主细胞筛---筛选阳性重组体实验室提供条件-材料质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA

R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验室提供条件-试剂蓝白T载体（天恩泽）快速DNA连接试剂盒（碧云天）限制性内切酶：EcoRI（Fermentas）质粒提取试剂盒（百泰克或BioEASY）抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验室提供条件-仪器超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱台式高速离心机，大容量冷冻离心机PCR仪，紫外分光光度计水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等实验室要求进入实验室前要经过培训。进出实验室需签名及出入时间，当日实验结束须将物品归位并清洁。遵守实验室开放时间，防止无故拖延时间，影响进度。节省实验室一切资源。试剂盒须分装使用（如T载体、内切酶），避免多次冻融失效。共用试剂材料须统一配制准备（如感受态细胞，平板培养基板、电泳缓冲液储液等）节省试剂耗材（如将内切酶做成混合液，避免多次吸取造成浪费）。实验仪器尽量集中使用或者共用，以减少仪器设备损耗（如高压灭菌锅、制冰机、恒温摇床等）。报告上交时间实验报告提交时间：2014-7-5交电子版（每位同学一份）。电子版文件名：学号后3位-学生姓名-实验名称-年级专业-实验室电子版文件上传地址：

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