植物组织培养的一般技术

关于植物组织培养的一般技术植物组织培养的一般技术操作技术培养基的成分及作用培养基的种类与选择培养基的配制方法第2页,共36页，2024年2月25日，星期天操作技术洗涤灭菌无菌操作培养容器封口物的种类及制作第3页,共36页，2024年2月25日，星期天灭菌

有菌的范畴：凡是暴露在（未经处理的）空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。它的内部在未经证实之前，也应该作为有菌物体来看待。无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，经其他物理或者化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。高层大气、岩石的内部，健康的动物和植物不与内外部表面接触的组织内部很可能是无菌的。强酸强碱、化学灭菌剂等表面和内部是无菌的。无菌的世界远远小于有菌的世界！第4页,共36页，2024年2月25日，星期天灭菌培养基的灭菌不耐热的物质将采用过滤灭菌玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌布制品采用高压灭菌其他植物材料的表面灭菌第5页,共36页，2024年2月25日，星期天培养基的成分及作用在完善的培养基配方中至少应包括下述几个部分：大量元素微量元素铁盐有机成分琼脂糖植物激素PH其它成分第6页,共36页，2024年2月25日，星期天大量元素植物所需要的元素，其浓度大于0.5毫摩尔/升应该属于大量元素大量元素包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等九种元素，他们占植物干重的百分之几十到万分之几生理作用：1）参与肌体构造；2）构成一些特殊的生理活性物质；3）电化学方面的作用:维持离子浓度平衡，胶体稳定，电荷平衡；4）发育方面起的作用：影响植物组织形态发生、器官形成。第7页,共36页，2024年2月25日，星期天微量元素植物所需要的元素，其浓度小于0.5毫摩尔/升应该属于微量元素。微量元素包括Fe、Cu、Mo、Zn、Na、Mn、Co

B和I等，通常培养基中添加10-7—10-5就可满足需要生理作用：酶的催化、细胞分化和维持细胞完整机能等方面第8页,共36页，2024年2月25日，星期天多年的研究结果：

Cu有促进离体根生长的作用；

Mo是合成活跃硝酸还原酶所必不可少的元素，也是固氮酶的组成部分，还有防止叶绿素受破坏的作用；

Mg、Zn、Na是酶的组成成份，也有防止叶绿素破坏的作用；

Mn与植物的呼吸作用和光合作用有关；

B与糖的运输、蛋白质的合成有关。第9页,共36页，2024年2月25日，星期天

当缺乏某种元素时，往往会表现一些缺素症：缺N：某些组织呈现鲜艳的花色素苷的色彩，导管不能形成；缺N、P、K：细胞变得肥肿而形成层组织减少；缺S：产生非常明显的黄萎病；缺Fe：细胞分裂停止；缺B：细胞分裂和细胞生长延缓；缺Mn或Mo：生长受影响。第10页,共36页，2024年2月25日，星期天铁盐采用硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠结合成螯合铁配置而成作用：促进细胞的分裂与生长；影响叶绿体的结构组成与叶绿素的形成。第11页,共36页，2024年2月25日，星期天有机成分维生素类：植物组织培养中经常使用维C、维B1（盐酸硫胺素）、维B6（盐酸吡哆素）、维H（生物素）、叶酸和烟酸等，一般使用的浓度为0.1——10mg/l肌醇：本身没有促进生长的作用，但有助于活性物质的发挥，并参与糖代谢，能使培养组织快速生长，对胚状体和芽的形成有良好的影响氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白、水解乳蛋白有机添加物：椰乳、香蕉等第12页,共36页，2024年2月25日，星期天琼脂一种从海藻中提取出来的凝固剂，一般使用浓度为0.6%—1%。以前使用琼脂条，现在使用琼脂粉，以色白、洁净的为好。第13页,共36页，2024年2月25日，星期天糖糖的作用：a.作为C源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架；b.为细胞的呼吸代谢提供底物与能源；c.维持一定的渗透势。使用最广泛的是蔗糖和葡萄糖，一般的使用浓度为2%—4%。一般来说，以蔗糖做糖原时，离体的双子叶植物的根生长得最好，而以葡萄糖为C源时，单子叶植物的根生长得最好。为了节省成本，一般选用食用白糖。第14页,共36页，2024年2月25日，星期天植物激素生长素类细胞分裂素类其它植物激素赤霉素（GA3）脱落酸（ABA）多效唑（PP333）第15页,共36页，2024年2月25日，星期天生长素类主要作用：诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽和不定芽的产生。常用的生长素类物质：2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸）、NAA（奈乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）。它们作用强弱顺序：2，4－D>NAA>IBA>IAA第16页,共36页，2024年2月25日，星期天细胞分裂素类主要作用：促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其它的激素作用。常用的细胞分裂素类有：KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2－iP（2－异戊烯腺嘌呤）、4PU、CPPU（吡效隆）和TDZ（噻重氮苯基脲）。作用的强弱顺序：TDZ,4PU>ZT>2－iP>6-BA>KT。第17页,共36页，2024年2月25日，星期天PH培养基的PH值，直接影响离子的吸收，过酸过碱对材料的生长都不利。对大多数植物来说，灭菌之前培养基的PH调到5.6—6.0能达到要求。主要用KOH和HCl来调节。一般来说，当PH值高于6时，培养基会变硬，低于5时琼脂不能很好的凝固。

第18页,共36页，2024年2月25日，星期天其它成分活性碳硝酸银香蕉泥、椰乳抗生素类物质第19页,共36页，2024年2月25日，星期天培养基的种类与选择培养基的种类培养基的选择培养基选择常用的试验方法第20页,共36页，2024年2月25日，星期天培养基的种类第一类为含盐量高的基本培养基，如MS、LS、BL、ER。第二类为硝酸钾含量高的基本培养基，如B5、N6、SH。第三类是无机盐中等含量培养基，如H基本培养基和Nitsch基本培养基。第四类为低盐含量基本培养基，如White、WS和HE基本培养基。第21页,共36页，2024年2月25日，星期天培养基选择1、基本培养基的选择（1）在选择一种新的植物材料进行组织培养时，为了尽快建立起再生体系，最好选择常用的一些培养基，如MS培养基；（2）如果MS培养基不理想，可首先降低它的浓度；（3）其次再选择在配料成分上与MS有显著不同的其它培养基加以试用对比。第22页,共36页，2024年2月25日，星期天培养基的选择2、激素浓度和相对比例的确定

在试验中，首先应参考已有的报道，看是否有用相同的植物、相同的组织或相近者做过成功或失败的试验，如果有则可直接作参考；如果没有，则在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择3－5个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方案。第23页,共36页，2024年2月25日，星期天16种激素配比实验方案第24页,共36页，2024年2月25日，星期天第25页,共36页，2024年2月25日，星期天常用的试验方法1、预备实验2、单因子实验3、多因子实验及正交设计4、广谱实验法5、逐步添加和逐步排除的实验方法第26页,共36页，2024年2月25日，星期天培养基的配制方法培养基成分的浓度换算体积百分比浓度重量百分比浓度摩尔浓度培养基母液的配制大量元素母液的配制微量元素母液的配制铁盐母液配制植物生长调节物质及其他有机物质母液的配制

第27页,共36页，2024年2月25日，星期天培养基配制程序第28页,共36页，2024年2月25日，星期天过滤灭菌装置第29页,共36页，2024年2月25日，星期天总结通过本章内容的学习掌握组织培养的一般操作技术理解培养基的成分及作用了解培养基的种类与选择第30页,共36页，2024年2月25日，星期天无菌操作第31页,共36页，2024年2月25日，星期天大量元素母液的配制大量元素母液浓度一般为原培养基浓度的10、20或50倍，有时也可用l00倍，倍数不宜过高，也不宜过低。有时将CaCl2·2H2O单独配制保存，以免长期贮存发生沉淀。将全部大量元素配在一起时，为防止在混合时发生沉淀，须在各药品充分溶解后，按表中顺序混合，氯化钙最后加入，以免与硫酸镁形成沉淀。称量大量元素的化合物用感量为0.01克的扭力天平即可。第32页,共36页，2024年2月25日，星期天微量元素母液的配制微量元素母液浓度宜为原培养基配方中用量的100倍。一般将微量元素分别称量溶解，贮存在一个瓶个，但也有将KI分别配制，单独贮存在棕色瓶中。称量微量元素化合物宜用感量为0.0001g的电子分析天平。第33页,共36页，2024年2月25日，星期天铁盐母液配制培养基中的铁盐母液一般单独配制目前常用的铁盐为硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物配制时，用感量为0.01g的扭力天平称取第34页,共36页，2024年2月25日，星期