大学课程：第二章 基因工程的基本原理及基本过程

Createdby：光辉邹磊印刷 PagePAGEIV DATE\@"M/d/yyyy"9/16/2002PAGE第二章基因工程的基本原理及基本过程2002年9月食品生物技术对人类的作用解决食品短缺，缓解由于人口增长带来的压力。（全球人口膨胀，“中国威胁论”）丰富食品种类，满足不同层次消费人群的需求。（提高生活质量）开发新型功能型食品，保障人类健康。（保健食品，功能食品）生产环保型食品，保护环境。（减少环境污染，降低腐烂率）开发新资源食品，拓宽食物来源本章应掌握的主要内容基因工程的概念和主要内容基因工程的原理和关键技术反义基因技术的概念、原理基因工程在食品中的应用第一节基因工程的基本原理和内容一、基本概念DNA（脱氧核糖核酸）RNA（核糖核酸）基因中心法则1、DNA（脱氧核糖核酸）由两条极性相反并互补的多聚核苷酸链围绕中心轴的双螺旋结构。两条链中的碱基之间按照A配T,G配C的互补原则，以氢键连接。其中A为：腺嘌呤T为：胸腺嘧啶G为：鸟嘌呤C为：胞嘧啶U为：尿嘧啶(RNA)（DNA双螺旋碱基配对图）DNA线性排列于染色体上，存在于细胞核中。DNA有自我复制的能力。（DNA自我复制示意图）2、RNA（核糖核酸）存在于细胞质中分别有三种功能不同的RNAmRNAtRNArRNAmRNA包含遗传密码，由DNA转录而来3、中心法则4、有关基因的概念基因是含有一定功能的DNA片段，是遗传的基本单位。获取某段有一定生理功能的DNA片段叫基因克隆。找出某段有一定生理功能的DNA片段在染色体上的位置叫基因定位。测定出某段有一定生理功能的DNA片段的碱基序列叫基因测序。按照一定的碱基序列，以核苷酸为原料，合成某段有一定生理功能的DNA片段叫基因合成。GeneticEngineering是生物技术的核心内容是现代高新技术的标志之一是世界科学技术革命的重要组成部分1、基因工程（意义）科学技术发展的火车头带动农业科学，医学，环境科学，信息科学等学科的快速发展。解决人类生存和发展的重要手段解决食品保证安全，揭开生命的奥秘，治疗疾病。强大的社会伦理冲击力遗传物质的传递打破伦理限制人类思想进步的推动者物种间的平等，解释宇宙生命现象，破除迷信和邪教涉及复杂的政治、外交斗争手段党派斗争，国际贸易争端2、基因工程概念用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成重组体，然后把重组体引入寄主细胞或个体中，使其得到高效表达，最终得到人们所需要的基因产物。3、基因工程的要点切接贴检4、基因工程基本过程利用重组DNA技术，在体外通过人工“剪切”（cut）和“拼接”（splice）等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行增殖，使重组基因在受体内表达，产生出人类需要的基因产物。5、基因工程主要内容在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定基因片段或人工合成的目的基因并制备载体。把获得的目的基因与制备好的载体用DNA连接酶连接组成重组体。把重组体转入宿主细胞。筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体和个体。6、基因工程的一般操作步骤目的基因的获得载体的选择重组质粒的构建导入目标生物体细胞内转基因重组体的获得转基因生物的鉴定7、所用的基本实验技术原核生物细胞中克隆载体的提取如质粒提取真核生物细胞中外源DNA的提取如基因组DNA的提取目的基因克隆如PCR技术表达载体的构建如DNA酶切、连接、转化基因转化技术如农杆菌介导的基因转化转基因鉴定技术如Southern杂交8、所采用的基本工具切限制性内切酶切割DNA分子接DNA连接酶连接DNA分子贴载体基因转化检杂交基因鉴定9、食品基因工程定义 利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏加工性状以及感官性状的技术。10、基因工程的特点生物的基因可以在人类、动物、植物和微生物四大系统间进行交流。对物种定向改造。（常规育种，辐射育种，航天育种）可以大大缩短育种年限。11、基因工程研究的对象 研究生物大分子，如：蛋白质、核酸、多糖等调节生命过程的物质，包括它们的功能、性状、代谢。如Bt蛋白，反义抑制基因表达，油脂改良，植物疫苗。12、基因工程的发展概况 1972年,Berg等首次用限制性内切酶EcoRI切割病毒SV40DNA和λ噬菌体DNA,组成重组DNA分子。这是首次DNA重组实验。 1973年，Cohen将伤寒沙门氏菌抗链霉素质粒与大肠杆菌抗四环素质粒在体外重组，获得异源的重组质粒DNA，并把重组质粒导入大肠杆菌中，建立了抗四环素和抗链霉素的重组质粒DNA，标志着基因工程的出现。 1986年，美国和英国科学家首次进行了抗除草剂转基因烟草的田间实验。 此后，基因工程技术迅猛发展，已经在农业、医药、食品、环保等领域显示出巨大的应用价值。 2000年全球的转基因作物种植面积有4420万hm2，为1996年的25倍。 转基因作物种植面积最大的前4个国家是美国、阿根廷、加拿大、中国，占全球的99.9%。 我国商品化的转基因植物为：转基因耐贮番茄，转查尔酮合成酶基因矮牵牛，抗病毒甜椒，抗病毒番茄，抗虫棉和保龄棉等。第二节工具酶和基因载体一、基因工程的工具酶 种类：限制性内切酶连接酶核酸酶碱性磷酸酶逆转录酶（一）限制性内切酶 1、发现：60年代初W.Arber等首次发现。大肠杆菌E.coliBλ噬菌体限制和修饰系统限制作用：一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致其侵染受到限制。修饰作用：寄主本身的DNA由于合成后通过甲基化酶的作用得到甲基化，使DNA得到修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。通常，用于基因转化的菌株为：（1）缺乏限制功能而具有修饰功能；（2）缺乏限制和修饰功能的菌株。2、限制性内切酶的定义 在细菌中有一种能够在特定位置上切割DNA分子的酶，这种酶就被称为限制性内切酶。Restrictionenzyme,简称RE3、限制性内切酶的分类(I,II,III) I型：多聚体蛋白质。作用时需要ATP、Mg2+、SAM。与DNA上未修饰的识别序列相互作用，然后沿DNA分子移动，在1000-5000个核苷酸距离后随机切割单链DNA。II型：分子量较小的单体蛋白质。作用时仅需要Mg2+即可维持活性。能在特殊位点切割DNA，产生具有粘性末端或其他形式的DNA分子片段。广泛应用于基因工程。III型：一些具有独特识别方式和切割方式的内切酶。如MboII4、II型限制性内切酶的命名和作用特点 命名原则:用具有某种限制性酶的有机体学名缩写来命名。用有机体属名第一个字母（大写，斜体）和种名的前两个字母（小写，斜体）构成基本名称。如果酶存在于特殊菌株中，则还加上菌株名称的符号。最后的罗马数字表示从该菌株中发现次酶的先后顺序。命名举例：HaeII:从Haemophilusaegypticus中提取的，并且是从中发现的第二种限制性酶。HinfI:从Haemophilusinfluenzae菌株f中纯化而得的。EcoRI:从大肠杆菌Escherichiacoli中分离出来的，R表示这种酶的基因在R质粒上。作用特点：识别位点序列一般是4个、5个、6个或8个碱基对。识别位点一般都是回文结构。产生粘性末端或平齐末端。(Cohesiveends)(bluntends)同裂酶:是指来自不同有机体但识别和切割相同DNA序列的酶。如HindIII与HsuI就是同裂酶。同尾酶:指来自不同有机体，并且不同识别序列的酶，但在切割DNA分子后，产生相同的末端，这种酶称为同尾酶。消化条件必须坚持应用推荐的反应条件。当反应条件改变时酶的专一性可能降低，以至同一种酶可识别和切割更多的位点，酶活性发生这种改变，常常在酶上加上星号，简称为酶的星活性。如EcoRI*5、限制性内切酶反应的终止65℃，温浴5分钟。适用于大多数限制性内切酶。变性剂：如尿素或SDS。耐热的酶如BamHI和HaeIII。DNA纯化：酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。6、限制性内切酶的主要用途在特异性位点上切割DNA，产生特异性限制性内切酶切割的DNA片段。建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱。构建基因文库用限制性内切酶切出相同的粘性末端，以便重组DNA。（二）DNA连接酶 能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶。(粘性、平端)催化DNA相邻的5‘磷酸基和3’羟基末端形成磷酸二酯键。1、种类 大肠杆菌连接酶需要NAD+（烟酰胺单核苷酸）只能连接粘性末端DNA片段T4连接酶需要ATP能连接粘性末端，也能连接平齐末端2、影响连接反应的因素 温度，离子浓度，DNA末端特性，DNA末端的浓度和分子量。（1）粘性末端的连接最适连接温度是粘性末端Tm值和DNA连接酶作用最适温度的折中，常用温度为14℃。使外源DNA片段浓度比载体DNA高10-20倍，可减少载体自连现象。用碱性磷酸酶预处理质粒载体。（无磷酸基不能连接，而外源DNA片段带有磷酸基）（2）平齐末端的连接连接反应复杂，速度显著减慢。高浓度的ATP会抑制平齐末端的连接。最适连接温度应接近反应中最小片段的Tm值，但不要超过37℃。（三）DNA聚合酶：负责DNA的复制或合成 （大肠杆菌）基因工程常用聚合酶 1、大肠杆菌DNA聚合酶I特性5‘-3’DNA聚合酶活性3‘-5’外切核酸酶活性5‘-3’外切核酸酶活性用途切口平移法标记DNA5‘-3’外切活性降解核酸作为cDNA合成引物3‘端标记进行序列分析2、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）特性5‘-3’DNA聚合酶活性3‘-5’外切核酸酶活性用途补平粘性末端随机引物法标记DNA3’端末端标记cDNA第二条链的合成3‘端标记进行序列分析双脱氧法DNA测序3、T4噬菌体DNA聚合酶特性5‘-3’DNA聚合酶活性3‘-5’外切核酸酶活性5‘-3’外切核酸酶活性用途标记3‘突出端DNA分子将双链DNA末端转化为平端补平或标记粘性末端使结合于模板的诱变引物延伸4、T7噬菌体DNA聚合酶特性已知DNA合成酶中持续合成能力最强。3‘-5’外切核酸酶活性为Klenow的1000倍用途用于长片段模板的引物延伸反应通过补平和交换反应进行快速末端标记5、耐热DNA聚合酶（Taq酶）特性从噬热菌中纯化而来。耐热的DNA聚合酶5‘-3’外切核酸酶活性用途聚合酶链式反应（PCR）对DNA片段进行体外扩增DNA测序6、末端转移酶特性在DNA分子3‘端加上多个脱氧核苷酸（A或G或T或C）不需模板，需要Co2+用途给载体或cDNA加上互补的同聚尾巴DNA片段3‘末端的放射同位素标记（四）碱性磷酸酶特性一种是大肠杆菌的BAP一种是牛小肠的CIP催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5‘磷酸基，产生5’羟基。用途去除DNA和RNA的5‘磷酸基，经过标记后进行序列分析。去除载体DNA的5‘磷酸基，防止载体自连。（五）S1核酸酶特点是特异性单链核苷酸外切酶，能降解单链DNA和单链RNA。用途去除DNA片段的单链突出端，使DNA成为平端。去除cDNA合成时形成的发卡结构用S1核酸酶保护实验进行基因表达分析内含子在基因组DNA中的定位。修整渐进性删除突变的末端（六）逆转录酶特性催化以单链RNA为模板生成双链DNA的反应。用途RNA指导的DNA合成反应DNA指导的DNA合成反应RNA的水解反应二、基因工程载体(vector)理想载体应具备的特征能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。在其DNA序列中有适当的限制性内切酶单一酶切位点。具有能够直接观察的表型特征。（一）质粒载体质粒(plasmid)是一种小的双链环状DNA分子，它们在细胞中能独立于染色体外进行自我复制，并包含各种功能的基因。构建质粒载体应考虑的方面分子量尽可能的小。了解载体上基因的位置、限制性内切酶的作用位点。在理想寄主中，载体应该容易繁殖。载体应包含一个可供选择的标记性状，从区别转化细胞和非转化细胞。应最大限度地具有各种限制性内切酶的切割位点。举例：pBR332大小为4363bp。含有抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因。抗四环素基因基因里有单一BamHI,HindIII,SalI酶切位点。抗氨苄青霉素基因里有单一的PstI酶切位点。带有一个复制起始位点，在大肠杆菌里高拷贝存在。举例：pUC19多克隆位点。含有一个氨苄青霉素抗性基因蓝白斑筛选重组体。举例：酵母质粒载体它既可在大肠杆菌中复制与扩增，又可以在酵母系统中复制与扩增，故又可称为穿梭质粒(shuttlevector)。选择酵母载体应考虑的因素：有适当的大肠杆菌和酵母遗传标志。考虑在酵母中的复制方式。在酵母和大肠杆菌中的拷贝数。简单易行的筛选插入物的方式。酵母质粒载体种类酵母整合型质粒(Yeastintergratingplasmids,YIp)酵母附加体质粒(Yeastepisomalplasmid,YEp)酵母的复制型质粒(Yeastreplicatingplasmid,YRp)酵母着丝粒质粒(Yeastcentromereplasmids,YCp)酵母丝状质粒(Yeastlinearplasmid,YLp)酵母表达载体(Yeastexpressionvector)酵母表达载体通过酵母表达载体，使外源基因在酵母内表达，产生人们所需的蛋白质。载体包括有效的启动子序列（诱导性或组成性）、目的基因cDNA和转录终止子）产品：乙肝疫苗，胰岛素，水蛭素等。举例：农杆菌质粒载体1、根癌农杆菌Ti质粒一般特性：是土壤微生物根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中的天然质粒，通过植物伤口，可以侵染广泛的双子叶植物，最终诱导植物伤口组织的增生形成冠瘿瘤，并在冠瘿瘤里合成冠瘿碱。农杆菌诱导Ti质粒诱导冠瘿瘤的形成冠瘿瘤是农杆菌唯一的碳源和氮源，其他生物不能利用。冠瘿碱包括章鱼碱和胭脂碱。Ti质粒也分为章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒的重要区域：1.T-DNA（transferDNA）区域2.