琼脂糖凝胶电泳

关于琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳技术第2页,共52页，2024年2月25日，星期天第3页,共52页，2024年2月25日，星期天第4页,共52页，2024年2月25日，星期天第5页,共52页，2024年2月25日，星期天按有无固体支持物分类第6页,共52页，2024年2月25日，星期天根据电泳支持介质的不同，常分为琼脂糖凝胶电泳(agarosegel)聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第7页,共52页，2024年2月25日，星期天琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖（agarose）是从海藻中提取的长链状多聚物，当加热至90℃左右时，形成清亮、透明的液体，冷却至45℃以下时，即可固化形成凝胶。第8页,共52页，2024年2月25日，星期天第9页,共52页，2024年2月25日，星期天琼脂糖凝胶电泳原理DNA分子带负电荷，来源于其磷酸骨架。因电荷密度均一，DNA分子所带电荷与分子量成正比。在无支持物的自由电场中，平均质量的牵引力相同，因此DNA分子无论大小都具有相同的迁移率，DNA由阴极端泳向阳极端。在凝胶电泳中，DNA分子的移动不再是自由的，受到凝胶支架的阻碍，凝胶孔隙起着分子筛的作用。第10页,共52页，2024年2月25日，星期天第11页,共52页，2024年2月25日，星期天

小分子颗粒小可从较小的孔中穿行，而大分子则必须饶道经大孔隙通过，因而迁移速度减慢。调节凝胶的浓度，便可将不同大小的DNA分子分离开。电泳是分离、鉴定、纯化DNA片段的简便而快速的方法。第12页,共52页，2024年2月25日，星期天琼脂糖电泳的用途判断扩增片断的大小回收扩增片断用于转印进行Southern印迹第13页,共52页，2024年2月25日，星期天问题

如何获得清晰的琼脂糖电泳照片呢？第14页,共52页，2024年2月25日，星期天琼脂糖电泳结果的影响因素凝胶电泳液电压检测手段第15页,共52页，2024年2月25日，星期天琼脂糖凝胶浓度的选择在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。第16页,共52页，2024年2月25日，星期天第17页,共52页，2024年2月25日，星期天第18页,共52页，2024年2月25日，星期天电泳缓冲液DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性。常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。第19页,共52页，2024年2月25日，星期天电泳缓冲液比较缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高复杂DNA；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE第20页,共52页，2024年2月25日，星期天琼脂糖凝胶中DNA的检测凝胶中核酸染色方法：

溴化乙锭(EB)染色法染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15％在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。第21页,共52页，2024年2月25日，星期天第22页,共52页，2024年2月25日，星期天第23页,共52页，2024年2月25日，星期天电压琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。随着电压的增高，电泳分辨率反而下降。对于大分子DAN片断，电场强度不宜高于5V/cm。但对于小片断的DNA可以5-20V/cm电压电泳第24页,共52页，2024年2月25日，星期天凝胶制备的注意事项1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长3、EB含量要适当4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，5、检查梳子6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度7、凝胶稍厚些，避免样品溢出第25页,共52页，2024年2月25日，星期天第26页,共52页，2024年2月25日，星期天第27页,共52页，2024年2月25日，星期天第28页,共52页，2024年2月25日，星期天第29页,共52页，2024年2月25日，星期天第30页,共52页，2024年2月25日，星期天第31页,共52页，2024年2月25日，星期天第32页,共52页，2024年2月25日，星期天第33页,共52页，2024年2月25日，星期天第34页,共52页，2024年2月25日，星期天第35页,共52页，2024年2月25日，星期天第36页,共52页，2024年2月25日，星期天第37页,共52页，2024年2月25日，星期天第38页,共52页，2024年2月25日，星期天第39页,共52页，2024年2月25日，星期天第40页,共52页，2024年2月25日，星期天第41页,共52页，2024年2月25日，星期天第42页,共52页，2024年2月25日，星期天第43页,共52页，2024年2月25日，星期天电泳时间PCR产物，应该在24h之内电泳电泳时间不易过长，对于长片断影响不大，但对小片断DNA影响明显电泳期间，EB向阴极迁移，与DNA迁移方向相反，长时间电泳将导致凝胶中EB含量显著较少，小片断DNA检测发生困难第44页,共52页，2024年2月25日，星期天第45页,共52页，2024年2月25日，星期天电泳上样量中号梳子：8—10ul小号梳子：6—8ul上样注意事项：

1、加样时应悬空

2、加样尽可能快

3、不必每一个样品用一个吸头

4、上样量中DNA含量过高，容易产生“弯月亮”第46页,共52页，2024年2月25日，星期天凝胶拍照曝光时间：6--10s拍照尺寸的选取：选用大的尺寸拍摄可获得清晰的电泳图片一般拍摄两次才可以得到清晰的照片第47页,共52页，2024年2月25日，星期天小结电泳图片的影响因素：凝胶，电泳液，EB，上样操作，拍照好的电泳图片不一定一次就可以获得第48页,共52页，2024