植物组培的培养基

关于植物组培的培养基目的要求：一、掌握培养基的种类及其特点三、掌握培养基的组成和其适宜剂量二、掌握MS培养基配制四、理解培养基筛选方法第2页,共60页，2024年2月25日，星期天

第一节培养基的种类和成分

一、培养基种类▼二、培养基成分▼第二节培养基制备▼一、母液配制和保存二、培养基配制、分装和灭菌▼第三节培养基的选择▼一、单因子试验二、多因子试验三、逐步增减法四、广谱实验法第3页,共60页，2024年2月25日，星期天一、培养基的种类

1、根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。

固体培养基是指加凝固剂的培养基。培养基中加入一定量的凝固剂，加热溶解后，分别装入常用的培养容器中冷却后即得到固体培养基。液体培养基是指不加凝固剂的培养基。

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培养基种类

固体培养基

液体培养基▲营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。二者比较第5页,共60页，2024年2月25日，星期天2、根据培养物的培养过程培养基分为：

初代培养基和继代培养基

外植体：从植物体上取出的用于无菌培养的植物材料。

植物材料：茎尖、茎段、花瓣、叶子、花药等

第6页,共60页，2024年2月25日，星期天初代培养：指用来第一次接种从植物体上分离下来的外植体过程。继代培养：对培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养。第7页,共60页，2024年2月25日，星期天

3、根据其作用不同，培养基分为：

诱导培养基

增殖培养基

生根培养基

4、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。

基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。

完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。第8页,共60页，2024年2月25日，星期天

常用培养基种类

MS培养基

B5培养基White培养基

N6培养基KM-8P培养基第9页,共60页，2024年2月25日，星期天★有机成分复杂，它包括了所有的单糖和维生素

用于原生质体培养(包括原生质融合的培养)KM-8P培养基特点：第10页,共60页，2024年2月25日，星期天N6培养基特点：1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计成分简单KNO3

和(NH4)2SO4含量高广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养等

第11页,共60页，2024年2月25日，星期天White培养基特点：1943年由Ｗhite为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作Ｗhite改良培养基。特点：无机盐含量较低适用：生根培养。第12页,共60页，2024年2月25日，星期天B5培养基特点：含较低的铵双子叶植物尤其木本植物组培可选择

第13页,共60页，2024年2月25日，星期天MS培养基特点：无机盐、离子浓度高，硝酸盐含量较高。

▲MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培生长所需的矿物质营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡

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二、

培养基成分

水

植物激素

无机盐

有机物培养体支持材料

辅助性物质▲第15页,共60页，2024年2月25日，星期天

一、无机盐▲

氮枝叶生长需要氮素，缺氮老叶先发黄；氮过量，枝叶过度茂盛。磷

缺磷，植株生长缓慢，老叶暗紫色。钾

促进花卉生长健壮，增强抗性，茎秆挺拔。缺钾，叶尖、叶缘枯焦，叶片呈皱曲状，老叶发黄或火烧状。钴

缺钴，叶片失绿而卷曲，整个叶片向上弯曲凋枯。第16页,共60页，2024年2月25日，星期天二、有机物维生素肌醇氨基酸天然复合物椰子汁（CM）酵母浸出液（YE)水解酪蛋白（CH)碳水化合物马铃薯汁液其它▲第17页,共60页，2024年2月25日，星期天碳水化合物选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等蔗糖浓度：2%～3%，胚培养为4%～15%大生产时可用白糖▲第18页,共60页，2024年2月25日，星期天

糖在培养基的作用：1）为细胞提供合成新物质的碳骨架2）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量3）维持渗透压第19页,共60页，2024年2月25日，星期天种类：

VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、VB3（烟酸）、Vc（抗坏血酸浓度：0.1－1.0mg/L作用：VB1

促愈伤组织产生，提高活力

VB6促根生长

Vc防组织褐变

VB3

与植物代谢和胚的发育有关系

维生素▲第20页,共60页，2024年2月25日，星期天

氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同，其种类和浓度不同。肌醇：又称环己六醇，在糖类的转化中起作用

第21页,共60页，2024年2月25日，星期天名称分子量溶解性质性质蔗糖342.30溶于水、乙醇无变旋现象山梨糖180.16溶于水甜味与蔗糖相似葡萄糖180.16溶于水有变旋现象，以游离态或磷酯形式存在果糖180.16溶于水、乙醇有变旋现象，甜度高于蔗糖盐酸硫胺素（VB1）337.28溶于水、乙醇、甘油受高温影响小，可高温消毒核黄素（VB2）376.37溶于无水乙醇、微溶于水等电点PH=6.0，碱性溶液中易变质，光能加速变质盐酸吡哆素（VB6）205.64溶于水、乙醇对光、空气、热稳定是转氨酶的辅酶钴胺素（VB12）1355.42溶于水、乙醇受高温影响小，可高温消毒，参与丝氨酸转变为甘氨酸过程烟酸（VPP）123.11极易溶于水、乙醇对空气、光、热、PH值稳定生物素（VH）244.31溶于水、乙醇对空气温度稳定叶酸（VM）441.40易溶于乙酸、NaOH、微溶于水参与生物甲基化作用抗坏血酸（VC）176.12极易溶于水有较强的还原能力，可做抗氧化剂用，参与酪氨酸代谢及色氨酸的羟基化作用肌醇180.16易溶于水植物中广泛存在，可能与IAA的代谢有关常见糖和维生素及其主要性质第22页,共60页，2024年2月25日，星期天椰乳：促愈伤组织和细胞培养，用量10－20%，使用注意茎尖大小香蕉泥：用量150－200ml/L，应用在兰花组培马铃薯汁液：用量150－200g/L，使苗壮水解酪蛋白：浓度100－200mg/L，应用在微茎尖培养天然复合物▲第23页,共60页，2024年2月25日，星期天

自然界中，植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、生长、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许多生理生化活动。

在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等。通常，不同植物，或不同品种，甚至同一植物的不同位置对激素的要求有很大的变化，这主要取决于植物的内源激素水平。组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）三、激素第24页,共60页，2024年2月25日，星期天（一）、激素的种类：1、生长素类：在自然界中，生长素影响茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象

在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织）

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组织培养中常用的生长素：

1二氯苯氧乙酸（2，4－D）

2萘乙酸（NAA）3吲哚乙酸（IAA）

4吲哚－－3－丁酸（IBA）NAA、IAA、IBA被广泛用于生根，2，4－D有利于愈伤组织的诱导和生长。

IAA容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。

溶解方法：1MNaOH或95％酒精，以前者为好保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存第26页,共60页，2024年2月25日，星期天2、细胞分裂素自然界中，细胞分裂素影响细胞分裂，顶端优势的变化和茎的分化等

组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。常用的细胞分裂素有：6－苄氨基嘌呤（6－BA）

激动素（6-糠氨基嘌呤、KT）

玉米素（ZT）

噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ）

溶解方法：1MHCL

保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存第27页,共60页，2024年2月25日，星期天3、赤霉素由日本人黑泽1926年发现。自然界中，赤霉素能够打破休眠、促进果实成长等效果。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。虽然也有赤霉素能刺激不定胚发育成正常小植株的报道，但在使用中仍需慎重，不可轻易添加。赤霉素有20多种，其中在组织培养中最常用的是GA3。在组织培养中与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不太常用，据报道赤霉素能刺激不定胚正常发育成小植株溶解方法：95％酒精保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解

灭菌：高温易分解，要过滤灭菌第28页,共60页，2024年2月25日，星期天4、脱落酸在自然界中，脱落酸能阻碍发育、促进老化、形成休眠芽等作用。

经试验表明，脱落酸有利于胚性愈伤组织形成正常不定芽。

材料的试管保存，加上脱落酸能抑制生长，使继代培养时间延长。溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。保存：具有热稳定性，但容易发生光解。配成一定浓度后，冰箱冷藏保存第29页,共60页，2024年2月25日，星期天（二）、常见培养基中植物激素配方类型激素配方再生方式及用途1.无植物激素诱导生根、无性胚、愈伤组织形成2.单加生长素诱导生根、愈伤组织、无性胚、不定芽3.单加细胞分裂素诱导不定芽、侧芽增殖、愈伤组织形成4.高生长素低细胞分裂素诱导芽、原球茎增殖、愈伤组织形成5.低生长素高细胞分裂素诱导丛芽、愈伤组织形成6.低生长素低细胞分裂素诱导不定芽、侧芽增殖7.等量生长素与细胞分裂素诱导侧芽增殖8.加生长抑制剂（多效唑、矮壮素等）壮苗、延缓生长、利于试管苗保存9.加GA3打破种子、芽休眠，促进伸长生长第30页,共60页，2024年2月25日，星期天名称分子量溶解性质主要作用吲哚乙酸（IAA）175.19易溶于热水、乙醇、乙醚、丙酮促进细胞的延伸生长和细胞壁结构的松驰，也可用于诱导生根吲哚丁酸(IBA)203.24溶于醇、丙酮、醚稀碱、稀酸液为生根刺激剂

a-萘乙酸(NAA)186.20易溶于热水、丙酮、醚、乙酸、稀碱液促进细胞生长，刺激生根2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)221.04易溶于醇、丙酮、乙醇、稀碱液促进愈伤组织形成赤霉酸(GA3)346.38易溶于醇、乙酸乙酯、碳酸氢钠和醋酸钠的水溶液，其钠促进茎、叶伸长生长，打破休眠（三）、常见生长调节剂及主要性能一览表第31页,共60页，2024年2月25日，星期天（四）、常见生长调节剂的微摩尔/升浓度与毫克/升的换微摩尔/升毫克/升IAAIBANAA2,4-DKTBA2iPZTTDZGA310.1750.20320.18620.22100.21520.22530.20270.21900.22020.346420.35040.40640.37240.44210.43040.45050.40540.43800.44040.692730.52550.60940.55860.66310.64560.67580.60810.65700.66061.039140.70070.81280.74480.88420.86080.90100.81080.87600.88081.385550.87591.01600.93101.10521.07611.12631.01351.09501.10101.731961.05111.21921.11721.32621.29131.35161.21621.31401.32122.078271.22631.42241.30341.54731.50651.57681.41891.53301.54142.424681.40141.62561.48961.76831.72171.80211.62161.75201.76162.771091.57661.82881.67581.98941.93692.02731.82431.97101.98183.1173第32页,共60页，2024年2月25日，星期天四、培养体支持材料1.琼脂用量7－10g/L（0.7%-1%）注意：1若浓度过高，培养基就会变得很硬，营养物质就难于扩散到培养的组织中。

2当进行营养需要研究时，应注意不要使用琼脂，因为市场供应所有琼脂含有杂质，特别是含有Ca,Mg和微量元素。2.其它

卡拉胶、玻璃纤维、滤纸桥、海绵等▲第33页,共60页，2024年2月25日，星期天五、辅助性物质1.抗生素2.抗氧化物3.活性炭▲第34页,共60页，2024年2月25日，星期天

抗生素1.常用种类：青霉素链霉素庆大霉素等2.用量：5%－20%3.作用：防止由外植体内生菌造成的污染。4过滤灭菌

▲第35页,共60页，2024年2月25日，星期天

抗氧化物

常用抗氧化剂及使用：

半胱氨酸VC（50－200mg/L液洗涤外植体伤口表面）。活性炭

1.作用：具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度0.1－0.2%）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度0.3%）。利于胚胎培养。2.常用浓度：0.5－10g/L3.活性炭的作用

①对生长的抑制：其吸附了植物激素②对生长的刺激：其吸附了有抑制作用的物质▲第36页,共60页，2024年2月25日，星期天

第二节培养基配制一、母液配制与保存二、培养基配制第37页,共60页，2024年2月25日，星期天(一)母液配制流程图

称量

母液分装确定培养基

溶解

定容

贴标签保存于冰箱一、母液配制(以MS为例)第38页,共60页，2024年2月25日，星期天

称量药品

天平预置全显示清零称药第39页,共60页，2024年2月25日，星期天(二)母液配制要求：1.母液浓缩倍数：10-100，大量元素10；微量元素、铁盐100；有机物50；2.选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂3.防止沉淀4.激素母液浓度：1mg/ml,1次配成50或100ml5.激素溶解：IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容；

NAA先溶于热水或95%酒精再加水；2，4-D先溶于1MNaOH再加水；

KT、BA先溶于1MHCl再加水。

第40页,共60页，2024年2月25日，星期天为什么要配制母液？1）方便2）准确（有些成分量太小）3）母液要分类配，否则有些成分混合一起会产生沉淀以MS培养基为例：第41页,共60页，2024年2月25日，星期天MS培养基母液的配制第42页,共60页，2024年2月25日，星期天母液保存：在冰箱内

低温保存第43页,共60页，2024年2月25日，星期天二、培养基配制移母液调PH值培养基熬制灭菌称取蔗糖、琼脂扎口定容分装二次定容接种确定配方第44页,共60页，2024年2月25日，星期天

大量元素母液

微量元素母液

铁盐母液

有机物母液

取100ml取10ml取10ml取10ml注：MS培养基配制容量瓶要求：一次性移取，不能吸进吸气球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。移母液第45页,共60页，2024年2月25日，星期天用自来水定容至1升定容：第46页,共60页，2024年2月25日，星期天称取蔗糖、琼脂用自来水定容到1升取蔗糖25－30g，琼脂7－8g。第47页,共60页，2024年2月25日，星期天培养基熬制：3.将容量瓶中剩余的液体一并倒入铝锅中，摇晃使均匀。1.将定容好的培养液取1/3倒入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼脂，边煮边搅拌，防止糊底。2.用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。第48页,共60页，2024年2月25日，星期天用0.1MNaOH或HCl调PH值为6.0。调PH值：第49页,共60页，2024年2月25日，星期天分装：趁热分装，100ml的三角瓶约装入30－40ml。第50页,共60页，2024年2月25日，星期天扎口与灭菌:要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。培养基应及时灭菌，防止变质。第51页,共60页，2024年2月25日，星期天

灭菌后，应尽快地转移培养瓶使其冷却，一般应将灭菌后的培养基储藏于30℃以下的室内名，最好储藏在4－10℃的条件下。应当注意的是，某些生长调节物质如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素是不稳定的，不能和其他的培养基一起高压灭菌，而要进行过滤灭菌。第52页,共60页，2024年2月25日，星期天第三节培养基的选择一、单因子试验二、多因子试验三、逐步增减法四、广谱试验法第53页,共60页，2024年2月25日，星期天2种激素5种浓度的实验组合Ⅰ6－BA（mg/L)A1A2A3A4A5NAA（mg/L)B1B2B4B3B5B1A1B1A2B1A3B1A4B1A5B2A1B2A2B2A3B2A4B2A5B3A1B3A2B3A3B3A4B3A5B4A1B4A2B4A3B4A4B4A5B5A1B5A2B5A3B5A4B5A5第54页,共