限进性功能化纳米粒子薄膜卷柱固相萃取联合高效液相色谱测定大鼠血浆中吴茱萸碱和吴茱萸次碱

限进性功能化纳米粒子薄膜卷柱固相萃取联合高效液相色谱测定大鼠血浆中吴茱萸碱和吴茱萸次碱【摘要】目的：创建一种采取限进性功能化纳米粒子薄膜微卷柱固相萃取结合HPLC-UV检测的新方法，简化血样前处理步骤，最终达成准确、便捷测定大鼠血样中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱目的。方法：利用实验室前期准备的限进性纳米粒子薄膜卷柱对大鼠血浆样品进行前处理，进行固相萃取并富集血样中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱，再利用高相液相联合紫外分析仪检测其含量。色谱条件：WondasilC18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；流动相组成为：0.1%磷酸-水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）；梯度洗脱时间程序为：0~15min：68~28%（A），17~37%（B），15~35%（C）），15~25min：维持28%（A）、37%（B）、35%（C）不变）；进样量20μL，流速1.0mL/min；吴茱萸碱检测波长为230nm，吴茱萸次碱检测波长为344nm。结果：吴茱萸碱的标准曲线为A=74.224c+10.065，相关系数R=0.9972，在0.113~11.3μg/mL之间呈良好的线性关系。吴茱萸次碱的标准曲线则为A=115.66c-13.205（R=0.9984），在0.0936~9.36μg/mL间呈良好的线性关系。吴茱萸碱日内精密度为5.77~7.07%，面积绝对回收率61.0~64.5%，浓度相对回收率为77.3~80.7%；日间精密度为5.63~8.70%，面积绝对回收率为74.9~78.1%，浓度相对回收率为78.3~84.3%。吴茱萸次碱日内精密度为5.78~7.44%，面积绝对回收率为61.0~64.5%，浓度相对回收率为90.4~105%；日间精密度为3.42~14.2%，面积绝对回收率为60.0~64.8%，浓度相对回收率为94.0~114%。【关键词】限进性纳米粒子；薄膜卷柱；固相萃取；高效液相色谱；血浆；吴茱萸碱和吴茱萸次碱DeterminationofEvodiamineandRutaecarpineinRatPlasmabyHighPerformanceLiquidChromatographyCoupledwithRestrictedAccessRollColumnSolidPhaseExtractionCombinedwithrestrictedfunctionalizednanoparticles[Abstract]Objective:Toestablishanewmethodforthedeterminationofevodiamineandrutaecarpineinratbloodsamplesaccuratelyandconvenientlybyusingrestricted-access-nanoparticle-functionalizedfilmrollcolumnsolidphaseextractioncombinedwithHPLC-UVdetection,simplifyingthepretreatmentstepsofbloodsamples.Methods:Theplasmasamplesofratswerepretreatedwiththerestrictedaccessfilmrollcolumnpreparedinthelaboratoryforextractingevodiamineandrutaecarpine.Followingthat,HPLCanalysiswasusedtodetectthecontentsoftwocomponents.Chromatographicconditions:wondasilC18column(4.6mm)×250mm,5μm）；themobilephaseconsistsof0.1%phosphoricacidwater(A),methanol(B),andacetonitrile(C);thegradientelutiontimeprogram:0~15minutes:68~28%(A),17~37%(B),15~35%(C)),15~25minutes:maintain28%(A),37%(B),and35%(C)unchanged;Injectionvolume:20μL.Flowrate:1.0mL/min;Thedetectionwavelengthofevodiamineis230nm,andthatofrutaecarpineis344nm.Results:ThestandardcurveofevodiaminewasdetectedasA=74.224c+10.065(R=0.9972),withagoodlinearrelationshipovertherangeof0.113~11.3μg/mL.ThestandardcurveofrutaecarpinewasdetectedasA=115.66c-13.205(R=0.9984),withagoodlinearrelationshipovertherangeof0.0936~9.36μg/mL.Forevodiamine,intradayprecisionswere5.77~7.07%,theabsoluterecoveryratesofareaswere61.0~64.5%,andtherelativerecoveryratesofconcentrationswere77.3~80.7%;inter-dayprecisionswere5.63~8.70%,theabsoluterecoveryratesofareaswere74.9~78.1%,andtherelativerecoveryratesofconcentrationwere78.3~84.3%.Forrutaecarpine,intradayprecisionswere，5.78~7.44%theabsoluterecoveryratesofareaswere61.0~64.5%,andtherelativerecoveryratesofconcentrationswere90.4~105%;inter-dayprecisionswere3.42~14.2%,theabsoluterecoveryratesofareaswere60.0~64.8%,andtherelativerecoveryratesofconcentrationswere94.0~114%.[Keywords]RestrictedaccessnanoparticlesFilmrollcolumnSolidphaseextractionHighperformanceliquidchromatographyPlasmaEvodiamineandRutaecarpine目录TOC\o"1-3"\h\u1前言 .3研究思路当前有关血样中吴茱萸活性成分分析的文献里，血样的前处理方法主要有蛋白质沉淀法、固相微萃取、液液萃取法、固相萃取法等，这些常用方法都有不足之处需要进一步改进。例如，栾连军等[29]检测血浆中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱时，采用蛋白质沉淀法加入有机溶剂处理血样，该法简便但不能完全除去杂质，净化效果较低。液液萃取操作繁琐，超临界流体萃取存在成本高以及易受脂类成分干扰的缺点[30]。而普通SPE前处理缺点主要是需要进行血样蛋白沉淀，除去蛋白后才能进行SPE处理，步骤繁琐，耗时长，易造成目标组分损失。相比较而言，限进性SPE处理，不需要蛋白沉淀，直接进行SPE处理，在省时省力，提高萃取效率上具有很大优势。因此，针对上述不足，本论文研究拟采取限进性材料固相萃取法作为血样前处理手段，相比现有文献的前处理手段具有能够直接处理血样，极大节省了前处理时间，操作便捷等优势，可以避免待测目标成分损失，实现回收率高、除杂效果好等目标。高效液相色谱灵敏度高、线性范围宽同时选择性较好，对环境温度变化、流动相组成变化和流速波动不太敏感。而消光系数低或光吸收小的物质也可用紫外检测器进行微量分析，操作方便。本实验拟采用HPLC-UV法分离、检测经过SPE处理后得到的供试品中的中药吴茱萸活性成分。SiO2纳米粒子材料具备机械强度高，比表面积大，物理化学性质稳定，易于表面修饰等诸多优点，广泛的应用于环境检测、化学合成以及环境检测等领域。本课题实验拟在指导老师课题组前期研究成果基础上，采用限进性功能化二氧化硅纳米粒子修饰聚丙烯薄膜表面，然后做成薄膜卷柱，置于1mL一次性医用注射器内，组装成便捷式SPE装置。将其直接用于处理大鼠血浆样品，同时萃取吴茱萸碱和吴茱萸次碱成分，配合HPLC-UV检测，建立新型限进性薄膜卷柱SPE+HPLC-UV新方法，快速检测血浆中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱。与传统血样前处理技术相比，用功能性二氧化硅纳米粒子修饰的限进性薄膜卷柱（SPE）能够减少沉淀蛋白质大分子步骤，直接处理血样，达到纯化和富集活性成分目的，同时还能减少成分损失，为临床研究人体内药物活性成分带来新的更快速、便捷且准确的检测方式。2仪器与方法2.1仪器与试剂本实验所用到的实验仪器与溶液试剂见表2-1和表2-2。表2-1仪器仪器型号高效液相色谱仪色谱仪液相进样针电子天平氮吹仪台式高速小型离心机超声波清洗器斡旋震荡仪1mL医用注射器Agilent1200SerieseWondasilC18，4.6mm×250mm,5μm迪马公司，710SNR，50μL日本岛津，AUW220D型北京优晟联合科技有限公司，UGC-12T大龙兴创实验仪器（北京）有限公司，D2012plus昆山市超声仪器有限公司，KQ3200型MX-S浙江欧健医用器械有限公司表2-2试剂试剂规格吴茱萸碱标准品吴茱萸次碱标准品甲醇乙腈磷酸纯净水甲酸乙酸乙酯限进性薄膜卷柱成都瑞芬思生物科技有限公司成都瑞芬思生物科技有限公司色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司色谱纯GR，默克公司AR，天津市大茂化学试剂厂屈臣氏AR，广州牌化学试剂AR，广州牌化学试剂课题组制备2.2高效液相色谱检测条件设备仪器组成：安捷伦高效液相色谱仪1200型，低压压四元梯度泵，紫外检测器，20μL定量环。色谱检测条件：WondasilC18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；流动相组成：0.1%磷酸-水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）；采用梯度洗脱，时间程序：0~15min：68~28%（A），17~37%（B），15~35%（C），15~25min：维持28%（A），维持37%（B），维持35%（C）不变；进样量20μL，流速1.0mL/min，柱温为室温；检测波长：吴茱萸碱230nm，吴茱萸次碱344nm。2.3溶液配制2.3.1混合标准品溶液的配制用电子天平称取对照品吴茱萸次碱（RUT）2.34mg、吴茱萸碱（EVO）2.82mg、柠檬苦素（LIM）2.85mg、去氢吴茱萸碱（DEH）2.96mg于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到整体浓度水平为500μg/mL的混合对照品做储备液，封口膜封口并用锡箔纸进行避光处理，放置于冰箱进行低温保存。其中吴茱萸碱EVO浓度为564μg/mL，吴茱萸次碱RUT浓度为468μg/mL。500μg/mL水平的吴茱萸混合对照品储备液用甲醇稀释制得200μg/mL（EVO：226μg/mL，RUT：187μg/mL）水平吴茱萸混合液作为中间储备液。由中间混合储备液（200μg/mL）依次用甲醇稀释得到40（EVO：45.1μg/mL，RUT：37.4μg/mL）、10（EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）、5（EVO：5.64μg/mL，RUT：4.68μg/mL）、1（EVO：1.13μg/mL，RUT：0.936μg/mL）、0.5（EVO：0.564μg/mL，RUT：0.468μg/mL）、0.1（EVO：0.113μg/mL，RUT：0.0936μg/mL）μg/mL浓度水平的系列对照品混合工作液。2.3.2混合血浆工作溶液的配制10μg/mL水平的混合血浆工作液（EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）配制：取50μL40μg/mL水平吴茱萸混合液对照品溶液，加入150μL空白血浆混匀。依照类似方法，分别取不同体积的、不同浓度水平的混合对照品工作液，加入150μL空白血浆混匀，分别得到系列不同浓度水平的混合血浆工作液：5.0μg/mL(EVO：5.64μg/mL，RUT：4.68μg/mL）、1.0μg/mL（EVO：1.13μg/mL，RUT：0.936μg/mL）、0.5μg/mL（EVO：0.564μg/mL，RUT：0.468μg/mL）、0.1μg/mL（EVO：0.113μg/mL，RUT：0.0936μg/mL）。以10μg/mL水平的混合血浆工作液（200μL）为样品溶液，进行SPE条件优化；将上述系列血浆工作液分别按照SPE+HPLC方法进行检测，测定工作曲线；分别取1.0μg/mL(EVO：1.13μg/mL，RUT：0.936μg/mL)和5.0μg/mL（EVO：5.64μg/mL，RUT：4.68μg/mL）2个浓度水平血浆工作液进行日内、日间精密度和准确度检测，进行方法学考察。2.3.3磷酸缓冲盐溶液（PBS）的配制以50mL×10mmoL配制缓冲溶液：用分析天平精密称取一定量的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠分别于50mL容量瓶中，用纯水溶解定容至刻度线，得到10mmol/L相对应的溶液。取一定量的磷酸二氢钠于烧杯，将pH玻璃电极放置到溶液当中检测pH值，边加入一定量的磷酸氢二钠边摇晃烧杯使其混合均匀，直至pH计显示pH为4.0，按照同样的方法调配成pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的不同磷酸缓冲液溶液。2.4SPE操作最佳条件经实验考察得到最佳固相萃取操作如下：①活化：1×1mL甲醇、1×1mL纯水、1×1mLpH=7PBS缓冲液，抽吸5次②上样：200μL血浆工作液＋400μLpH=7PBS缓冲液，抽吸10次③淋洗：1×1ml纯水，抽吸5次④洗脱：0.5%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:12×500μL，抽吸7次用前期课题研究生制备的薄膜卷柱RAM-SPE装置，分别按以上操作步骤手动抽吸排液进行固相萃取，将最终的两份洗脱液合并，在室温下进行氮吹。吹干后用200μL甲醇复溶，斡旋振荡充分混合均匀，得到色谱供试品溶液，过滤器过滤，取20μL进样进行HPLC-UV检测。3实验结果与讨论3.1SPE吸附原理作为吴茱萸主要的活性成分，吴茱萸碱和吴茱萸次碱同属吲哚类生物碱，两者分子结构见图3-1。从图中可看出均存在多环结构，说明存在较强的疏水性。同时，两者分子结构中也都存在仲氮原子和叔氮原子，具有一定的碱性。两者均溶于丙酮，但微溶于氯仿、乙醇，几乎不溶于水、苯及石油醚。故本论文试验拟利用疏水性作用萃取两种活性成分。课题组前期制备了疏水性功能化的二氧化硅纳米粒子，即在二氧化硅纳米粒子表面接枝了以苯甲基为功能基团的疏水性网状功能层。然后将该二氧化硅纳米粒子通过亲水高分子链，相互链接于聚丙烯薄膜表面，制成薄膜卷柱，置于1mL一次性医用注射器内，组装成便捷式SPE装置。疏水性的苯甲基功能基团可与吴茱萸碱和吴茱萸次碱发生相互作用使目标成分吸附于纳米粒子表面，而外表面亲水基团可排阻生物大分子如血浆蛋白基质进入，形成限进功能层。利用该便捷式SPE装置手动进行抽吸排液操作，无需再进行事先蛋白沉淀，能够直接处理血样，快速、便捷地萃取血样中的EVO和RUT。有效提高萃取效率，同时加快样品前处理进程。吴茱萸碱吴茱萸碱(Evodiamine,EVO)吴茱萸次碱(Rutecarpine,RUT)图3-1吴茱萸碱（EVO）、吴茱萸次碱（RUT）的结构式3.2色谱检测条件的确定由于需要用到高效液相色谱仪进行色谱分析，合适的色谱检测条件可确保结果的准确性和精密度符合分析方法学要求，故对色谱条件进行了考察。吴茱萸碱测定波长为230nm，吴茱萸次碱的为344nm，此为2种成分最大吸收波长，可以得到灵敏检测信号值。以混合标准品溶液（10μg/mL浓度水平）为对照品考察四种活性成分的色谱分离条件。初始条件以0.1%磷酸水-甲醇-纯水-乙腈作流动相，梯度洗脱，发现RUT和EVO分离效果不佳而DHE和LIM分离情况明显，后续调动流动相比例、梯度顺序以及改变洗脱强度。最终调整为0.1%磷酸水（A）-甲醇（B）-乙腈（C），进行梯度洗脱时前期15min保持每个流动相洗脱强度以一定的速度增加到最大限度，后续10min保持洗脱强度不变，能够很好的分开四种活性成分。最终确定色谱条件为：①流动相：0.1%磷酸-水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）；②采用梯度洗脱，时间程序：0~15min：68~28%（A），17~37%（B），15~35%（C），15~25min：维持28%（A），维持37%（B），维持35%（C）不变。图3-2为混合标准品和混标血浆工作液的高效液相色谱图。由图所示，EVO的出峰时间为15.83min左右，RUT则为17.67min左右，2个成分均能基线分离，出峰附近无杂质峰干扰。图3-2混合标准品、血浆工作液色谱图A：10μg/mL混合标准品（DHE：11.8μg/mL，LIM：11.4μg/mL，EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）；B：经固相萃取的10μg/mL血浆工作液（DHE：11.8μg/mL，LIM：11.4μg/mL，EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）3.3SPE条件考察前期用标准品对限进性薄膜卷柱进行初步优化，得到SPE初始操作条件为：①活化：1×1mL甲醇，1×1mL纯水，分别抽吸5次；②上样：200μL血浆工作液＋200μLPBS缓冲液，抽吸8次；③淋洗：1×1mL纯水，抽吸5次；④洗脱：2×500μL1%甲酸乙酸乙酯:甲醇=1:1分别抽吸7次；⑤洗脱液在室温下用氮气吹干，加入200μL甲醇复溶，涡旋混匀，以此为色谱供试品溶液，过滤后进HPLC检测。从上述初始条件出发逐项考察优化SPE操作条件。在考察某个条件时，其它操作不变。以10μg/mL浓度水平的混合血浆工作液溶液为样品进行SPE条件考察，通过比较洗脱回收率（ω回收）选择最佳条件。ω回收计算如下：ω回收(%)=其中，ω回收为最后得到的洗脱回收率，A洗脱为洗脱液吹干后复溶得到的色谱供试品溶液中EVO、RUT的检测峰面积，A标为10μ3.3.1SPE上样条件1）pH值的影响吴茱萸碱和吴茱萸次碱均具有一定碱性，上样溶液pH值有可能对2种活性成分在薄膜卷柱上的吸附较大影响。为此，首先考察上样溶液pH条件对吸附效果的影响。以200μL混标血浆工作液（10μg/mL水平）加入400μL不同pH值PBS缓冲液控制上样液的pH值，加入的缓冲液同时也能稀释血浆溶液，降低其粘度，有利于上样抽吸排液操作。表3-1列出了不同pH值PBS缓冲液条件下上样SPE处理后最后得到的洗脱回收率值。从表中数据可看出，EVO和RUT都是在中性、偏碱性条件下回收率较大。EVO的回收率在pH=5、6、7时处于最大平台区域，其中pH=7时达到最大值（65.6%），在酸性更大、碱性更强区域，回收率则明显下降。回收率随碱性增强而减小，可能是因为其为生物碱EVO去质子化，作用力增强导致洗脱率不断减小最后连50%不到，而酸性过强则可能导致样品溶液中EVO质子化带上电荷，使得上样吸附率下降从而造成最终洗脱回收率下降。而RUT随碱性增强，洗脱率也随之增强，可能是加碱可致RUT去质子化，有利于疏水性作用，故而上样吸附率增大导致最终洗脱回收率增大。在偏酸性条件下，同样因为质子化，RUT上样吸附率减小，最后的洗脱回收率也下降。由于SPE萃取是要同时萃取四种活性成分（LIM、DHE、EVO、RUT），上样pH值要兼顾四种成分的回收率，最终确定pH=7的PBS的缓冲溶液来控制上样pH。表3-1不同pH值缓冲溶液考察不同pH值PBS缓冲溶液ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）4567891051.761.162.465.659.053.349.564.266.170.879.777.579.379.0注：①每个条件下平行测定3次，计算最最后一步得到洗脱面积绝对回收率平均值；②SPE操作条件：改变不同上样血浆溶液pH值，淋洗、洗脱操作不变。2）上样抽吸排液次数的影响表3-2上样抽吸次数考察上样抽吸次数ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）246810111254.264.372.277.280.780.275.657.767.773.182.580.977.978.7注：①每组平行操作重复三次，检测其洗脱率。②SPE操作条件：确定上样稀释条件为400μLpH=7，淋洗、洗脱操作不变。确定缓冲溶液pH值后，对上样抽吸次数进行考察。如表3-2所示，当上样抽吸次数为十次时，EVO和RUT的洗脱回收率均达到80%以上，回收率最好，往后随抽吸次数越多洗脱率均略微下降，可能次数过多会导致部分成分又重新残留到柱内，故选抽吸次数为10次作为最优上样次数。上样条件最终确定为：200μL血浆工作液+400μLpH=7PBS缓冲溶液，抽吸10次。3.3.2淋洗液考察无淋洗、1×1mL、2×1mL三组不同淋洗体积的洗脱效果，选取最优淋洗条件。由于SPE薄膜卷柱外表面存在亲水高分子层，大部分的血浆基质蛋白可直接流出萃取柱，但仍会剩下少部分残留于亲水高分子链层中。如果这些残存的血浆基质大分子蛋白质不淋洗下来，则后续洗脱液中的有机溶剂（甲醇等）则会使其变性凝固于亲水链层内，影响目标分子渗透穿过亲水高分子链层，最终可影响后续柱子的使用寿命。因此，有必要进行适当的淋洗，将这些残留的亲水性蛋白基质成分去除。本实验采用纯水作为淋洗液将残留的血浆蛋白基质成分淋洗下来，同时依靠疏水性作用保留于SPE薄膜卷柱表面的目标分子则基本上不受影响。实验中考察了淋洗液体积对最终洗脱回收率的影响。如表3-3所示，无淋洗时，EVO和RUT的洗脱回收率较好，考虑到若无淋洗步骤，最后的洗脱液会导致因蛋白质等杂质附着于柱上无法洗脱下来而造成柱压增大和柱子使用寿命减短的问题，最终选择1份1mL（1×1mL）纯水进行淋洗操作。表3-3淋洗体积考察淋洗体积ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）1×1mL2×1mL0mL78.470.693.180.081.488.5注：每组平行操作重复三次，检测其洗脱率。3.3.3洗脱剂1）洗脱剂种类根据有关文献可知，EVO、RUT（包括DHE）易溶于丙酮、DMSO，在甲醇、乙醇中微溶，LIM在乙酸乙酯中有较好溶解性。因此，有必要对洗脱剂种类及其组成进行考察，以得到理想的洗脱效果。实验首先考察了洗脱溶剂种类的效果。如表3-4所示，乙酸乙酯:甲醇=1:1洗脱效果最好。单独采用乙酸乙酯洗脱时，发现洗脱液中有呈椭圆状透明絮状物存在的现象，疑似EVO和RUT溶解效果不佳造成。单独采用甲醇洗脱时，EVO、RUT都有较好的洗脱回收率。单独采用乙腈洗脱效果不佳，可能是与在乙腈中溶解性不如甲醇有关。为了兼顾LIM的洗脱效果，考考察了添加乙酸乙酯洗脱效果。甲醇比乙腈的洗脱效果更好，故采用甲醇与乙酸乙酯按不同体积比例混合作洗脱剂，考察其洗脱效果。如表所示，两者1:1时洗脱回收率均达到80%以上。提高乙酸乙酯比例，达到乙酸乙酯:甲醇=4:1时，洗脱液中出现透明絮状物现象，可能是有些成分在乙酸乙酯中溶解性不好导致。故舍弃乙酸乙酯和乙酸乙酯:甲醇=4:1作洗脱液。经检测，检测物均达到80%以上，有良好的线性关系。表3-4洗脱种类考察洗脱液种类ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）乙腈甲醇乙酸乙酯:甲醇=1:1乙酸乙酯:甲醇=2:1乙酸乙酯:甲醇=1:2乙酸乙酯:甲醇=1:455.687.389.568.167.068.166.477.381.479.973.366.9注：①每组平行测定3次，计算平均值；②洗脱液体积为：2次×500μL；抽吸次数7次。2）洗脱剂酸碱性洗脱液不同酸碱的效果见表3-5。在乙酸乙酯/甲醇（1:1）混合溶剂中加甲酸的洗脱效率不如氨水的高，且氨水为0.5%时RUT洗脱率达到92.0%，但EVO仅达到77.1%，明显低于不加氨水的效果。综合考虑其它两种成分的洗脱回收率也是在此条件下最好（DHE：100%、LIM：59.3%），最终确定洗脱剂为0.5%氨水的乙酸乙酯/甲醇混合溶液（v/v，1:1）。表3-5不同酸碱浓度洗脱条件考察洗脱液种类ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）1%甲酸-乙酸乙酯:甲醇=1:10.5%甲酸-乙酸乙酯:甲醇=1:11%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:10.5%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:163.463.166.277.174.076.078.992.0注：①每组平行测定3次，计算平均值；②除洗脱液种类变化外，其他SPE操作保持不变。3）洗脱剂体积和抽吸次数实验中进一步考察了洗脱液体积和抽吸排液次数的效果（见数据表3-6和3-7）。由数据可知，洗脱体积500μL×2比600μL×2的洗脱效率更好，抽吸次数为7次时洗脱率最好，两个表的数据呈坡度趋势，中间值为最优。最终确定洗脱体积为500μL×2，洗脱抽吸次数为7次。最终确定SPE操作过程为：①活化：1×1mL甲醇、1×1mL纯水、1×1mLpH=7PBS缓冲液，抽吸五次；②上样：200μL血浆工作液＋400μLpH=7PBS缓冲液，抽吸10次；③淋洗：1×1ml纯水，抽吸5次；④洗脱：添加0.5%氨水的乙酸乙酯/甲醇混合溶液（v/v，1:1）2×500μL，抽吸7次。表3-6洗脱体积考察洗脱液体积ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）300μL×2500μL×2600μL×260.871.469.173.587.784.4注：①每组平行操作重复三次，计算平均值，检测其洗脱率；②洗脱种类为0.5%氨水乙酸乙酯：甲醇=1：1，洗脱每组抽吸7次。表3-7洗脱抽吸次数考察洗脱抽吸次数ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）35791063.768.371.465.568.975.583.987.780.984.0注：①每组平行操作重复三次，检测其洗脱率；②洗脱体积为500μL×2，上样，淋洗操作保持不变。3.4方法学验证3.4.1工作曲线测定按照优化的SPE操作条件，以及确立的色谱分析条件，分别检测不同浓度的混合血浆工作液，以得到的色谱峰面积为纵坐标（Y轴），对应的浓度（μg/mL）为横坐标（X轴），绘制工作曲线，作一元线性回归，得到EVO和RUT工作曲线方程（见数据表3-8和图3-4）。吴茱萸碱在0.113~11.3μg/mL浓度间呈良好的线性关系，回归方程为A=74.224c+10.065，R=0.9972；吴茱萸次碱在0.0936~9.36μg/mL间呈良好的线性关系，标准曲线则为A=115.66c-13.205，R=0.9984。表3-8EVO和RUT不同浓度的峰面积cEVO(μg/mL)AEVOcRUT(μg/mL)ARUT0.1130.5641.135.6411.35.1039.396.94738260.09360.4680.9364.689.365.9056.493.74851090图3-4吴茱萸碱(EVO)和吴茱萸次碱(RUT)工作曲线3.5.2精密度和准确度分别对2个浓度水平的混合血浆工作液（1μg/mL、5μg/mL）进行SPE+HPLC检测，考察方法精密度和准确度。单日内，每个浓度水平的血样间隔一定时间各测定一次，共计平行测定三次，计算其三个浓度值RSD%作为日内精密度，浓度平均值与理论值比值（浓度相对回收率）作为准确度。连续测定三日，三日间同一时间段每个浓度水平血样测定浓度值计算平均值，与理论值比值（浓度相对回收率）作为日间准确度，用RSD%作为日间精密度（见数据表3-9和表3-10）。表3-9EVO日内、日间精密度测定加入量（μg/mL）日内日间c测（μg/mL）RSD(%)ω浓度(%)ω面积(%)c测（μg/mL）RSD（%）ω浓度(%)ω面积(%)1.135.641.407.307.075.7780.777.375.473.21.347.208.705.6384.378.374.978.1注：ω浓度(%)=(c测/c标)×100%，ω面积(%)=(A测/A标)×100%。表3-10RUT日内、日间精密度测定加入量（μg/mL）日内日间c测（μg/mL）RSD(%)ω浓度(%)ω面积(%)c测（μg/mL）RSD（%）ω浓度(%)ω面积(%)0.9364.681.044.475.787.4490.410564.561.01.004.113.4214.294.011464.860.0注：ω浓度(%)=(c测/c标)×100%，ω面积(%)=(A测/A标)×100%。由表可知，EVO的日内精密度值范围为5.77~7.07%，浓度相对面积范围为77.3~80.7%，面积相对回收率为73.2~75.4%；日间精密度范围为5.63~8.70%，浓度相对面积范围为78.3~84.3%，面积相对回收率为74.9~78.1%。RUT的日内精密度值范围为5.78~7.44%，浓度相对面积范围为90.4~105%，面积相对回收率为61.0~64.5%；日间精密度范围为3.42~14.2%，浓度相对面积范围为94.0~114%，面积相对回收率为60.0~64.8%。中、高浓度水平的检测结果均符合体内药物分析的药典规定（RSD≤15%）。上述数据中面积绝对回收率整体偏低，主要原因可能是SPE柱子问题。推测可能与柱子负载量偏低有关，也有可能是柱子亲水限进层排阻蛋白吸附效果不如预期。因为使用过程中发现柱子使用超过3~5次后，排液阻力明显增大，推测可能与蛋白吸附有关。后续还需要进一步改进SPE薄膜柱子的制备。4结论本论文实验研究探讨了限进性功能化纳米粒子薄膜卷固相萃取柱直接处理大鼠血样、萃取吴茱萸次碱和吴茱萸碱的效果。实验中采用高效液相色谱检测手段来评价SPE萃取条件优化效果，最终建立了SPE+HPLC分析新方法，检测大鼠血样中的这两种成分。分别对2个浓度水平血浆混合工作液进行了日内、日间精密度以及准确度检验，测定结果符合药典相关规定。实验中也发现，SPE的面积绝对回收率整体偏低，很大可能是由于柱子性能、负载量等还没有达到理想状态，致使柱子使用寿命、回收率不如预期好，这是今后需要改进的地方。参考文献[1]中国药典2020年版.一部[S].2020:178.[2]倪晓婷,李兆星,陈晨等.吴茱萸的化学成分与生物活性研究进展[J].中南药学,2022,20(03):1672-2981.[3]X.Jiang,Q.Wu,Y.Xiao,etal.Evodiaminepreventsisoproterenol-inducedcardiacfibrosisbyregulatingendothelial-to-mesenchymaltransition.PlantaMedica[J].PlantaMedica,2017,83(09)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