山竹壳中总氧杂蒽酮提取工艺优化及其对氧化损伤修复作用研究

山竹壳中总氧杂蒽酮提取工艺优化及其对氧化损伤修复作用研究【摘要】目的：优化山竹壳中总氧杂蒽酮的提取工艺，并探究其对氧化损伤的修复作用。方法:采用单因素试验方法对山竹壳中的总氧杂蒽酮提取工艺进行优化，以总氧杂蒽酮含量为指标，确定最佳提取条件；戊唑醇建造氧化损伤模型，评价肝脏中谷胱甘肽的含量作为肝氧化损伤的修复指标；通过电化学分析法测定其脑组织中多巴胺的含量，并采用ImageJ软件对斑马鱼自发运动轨迹及运动参数进行分析，作为神经损伤的修复指标。结果：采用单因素优化提取条件，得到最佳提取条件为：提取时间为1.5h、料液比为1：60g/mL、提取温度为50℃、乙醇体积分数为80%；模型组斑马鱼肝组织的GSH含量相较空白组下降34.9%，不同剂量的给药组相较模型组分别上升12.1%、23.1%和49.8%。此外，相较于空白组，模型组斑马鱼脑组织中多巴胺含量提升8.1%，给药后，斑马鱼脑组织中多巴胺含量基本恢复至空白组水平。斑马鱼自发运动轨迹及运动参数恢复至正常水平。结论：总氧杂蒽酮可显著促进斑马鱼肝脏氧化损伤的修复，并对斑马鱼的神经氧化损伤也具有一定的修复作用。【关键词】山竹壳；氧杂蒽酮；提取工艺；氧化应激修复作用；神经毒性修复作用

Optimizationofextractiontechnologyoftotalxanthonefrommangosteenshellanditsrepaireffectonoxidativedamage【Abstract】Objective:Tooptimizetheextractionprocessoftotalxanthonefrommangosteenshellandexploreitsrepairingeffectonoxidativedamage.Methods:Thesingle-factortestmethodwasusedtooptimizetheextractionprocessoftotalxanthoneinmangosteenshell,andthecontentoftotalxanthonewasusedastheindextodeterminetheoptimalextractionconditions.Tebuconazolewasusedasanoxidativedamagemodelinzebrafish,andthecontentofglutathioneintheliverwasevaluatedasanindicatorofliveroxidativedamagerepair.Atthesametime,thedopaminecontentinthebraintissuewasdeterminedbyelectrochemicalanalysis,andthespontaneousmovementtrajectoryandmovementparametersofzebrafishwereanalyzedbyImageJsoftwareasindicatorsofneuraldamagerepair.Results:Afteroptimizingtheextractionconditionsbysinglefactor,theoptimalextractionconditionswere:extractiontimeof1.5h,liquid-to-materialratioof1:60g/mL,extractiontemperatureof50℃,andethanolvolumefractionof80%.Comparedwiththeblankgroup,theGSHcontentinthelivertissueofthemodelgroupzebrafishdecreasedby34.9%,andthedifferentdosesofthedruggroupincreasedby12.1%,23.1%,and49.8%,respectively.Inaddition,comparedwiththeblankgroup,thedopaminecontentinthebraintissueofthemodelgroupzebrafishincreasedby8.1%.Afteradministration,thedopaminecontentinthebraintissueofzebrafishbasicallyreturnedtotheleveloftheblankgroup.Thespontaneousmovementtrajectoryandmovementparametersofzebrafishreturnedtonormallevels.Conclusion:Totalxanthonecansignificantlypromotetherepairofliveroxidativedamageinzebrafishandalsohaveacertainrepairingeffectonneuraloxidativedamageinzebrafish.【Keywords】：MangosteenshellxanthoneExtractiontechnologyOxidativestressrepairNeurotoxicrepaireffect目录1前言 [27]，在冰水浴下手动研磨5min使组织匀浆化。将匀浆液倒入1.5mL离心管中，2500转/分，离心10min，取上清液进行测定。取1mL上述步骤制得的脑组织上清液于烧杯中，加入19mL的人工脑组织作为供试品。使用CHI660E电化学工作站，采用饱和甘汞电极参比电极、铂片对电极、制得的修饰碳纤维电极作为工作电极，使用差分脉冲伏安法（DPV）作为测定方法，在起始电压为−0.3，终止电压为0.6V，脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为0.2s，脉冲周期为0.5s的条件下测定，记录峰高，见式(1)。斑马鱼脑组织多巴胺含量=溶液中多巴胺浓度C3.3总氧杂蒽酮对斑马鱼氧化损伤的修复作用取60尾斑马鱼，分为6组放入培养皿中，每组10尾斑马鱼于1.0L溶液，分别称为空白组、1%DMSO组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。空白组置于去离子水，DMSO组置于1%DMSO溶液，其余组置于0.5mg/L的戊唑醇溶液中，每2d更换一次水，给毒周期为4d；之后空白组和1%DMSO组重复上述步骤，毒性组置于1%DMSO溶液，其余组分别根据低（10mg/L）、中（25mg/L）、高（50mg/L）剂量给药（药物溶于1%DMSO），每2d更换一次水，给药周期为7d。按照3.3.3的方法，每组取5尾鱼测定其运动轨迹及其参数，记录数据；按照3.3.2和3.3.4的方法测定每组斑马鱼肝组织的谷胱甘肽含量及其脑组织的多巴胺含量，作为氧化损伤修复指标。

4实验结果与讨论4.1山竹壳中总氧杂蒽酮的单因素提取与含量检测提取时间、料液比、提取温度和乙醇体积分数对山竹壳中总氧杂蒽酮含量的影响结果如图2所示。图(a)表明，山竹壳中的总氧杂蒽酮的含量随着提取时间的增加而增加，直到1.5h，此时达到最高含量；如图(b)所示，料液比从1：40增加到1：60（mL/g）导致总氧杂蒽酮含量的显著增加，继续提高料液比对山竹壳总氧杂蒽酮含量无显著影响，这一观察结果说明，当溶剂不足时，提取液的浓度过高使固液两相之间的浓度梯度过小，总氧杂蒽酮无法完全溶出；相反，溶剂过多则会造成资源浪费。图(c)显示了提取温度对山竹壳中总氧杂蒽酮含量的影响，表明随着提取温度从30℃增加到50℃，含量相应增加，在50℃达到峰值，超过这个温度后，总氧杂蒽酮含量随之明显下降。图(d)中的研究结果说明，随着乙醇体积分数的增加，总氧杂蒽酮含量呈现出先升后降的趋势。当乙醇的体积分数为80%时，总氧杂蒽酮含量最高；这可能是由于当乙醇的体积分数超过80%时，溶剂极性减少，导致总氧杂蒽酮的溶解度降低。综合以上因素，确定提取时间为1.5h、料液比1：60g/mL、提取温度50℃、乙醇体积分数80%为最佳条件。注：a.提取时间影响图；b.料液比影响图c.温度影响图；d.乙醇体积分数影响图图2各种单因素对葡萄籽原花青素含量的影响4.2斑马鱼的氧化损伤模型评价如表3所示，当戊唑醇浓度为0.5mg/L死亡个体为0，致死率为0%，达到非致死浓度，故使用0.5mg/L的戊唑醇进行后续氧化损伤指标的检测。表3戊唑醇给药浓度及其致死率戊唑醇浓度（mg/L）死亡数（尾）致死率（%）0.000%0.500%0.7240%1.0360%2.05100%将空白组与模型组斑马鱼解剖后，按照3.3.2和3.3.4方法检测，结果如图3所示。对比可看出模型组斑马鱼肝组织内GSH含量具有极显著的下降，其多巴胺含量显著上升，说明建模后斑马鱼具有氧化损伤。注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著;***与空白组相比，p<0.001，差异极显著图3不同组斑马鱼体内GSH含量与脑组织中DA含量空白组、模型组斑马鱼2min内运动轨迹捕捉和运动参数如图4-5所示。由运动轨迹可看出，在建模后斑马鱼自发行为轨迹混乱。模型组的斑马鱼往中央区域游动，活跃性较高；而空白组则相对安静，活跃性较低。从静止时间上分析可知，模型组静止时间为最短，即其运动最为活跃，空白组则相较静止时间长，静止时间对比，空白组与模型组差异较显著。从移动距离上分析可知，模型组移动距离较长，处于活跃状态，与空白组相比，移动距离差异较显著。结果表明，模型组斑马鱼相较于空白组运动行为显著增强。综上说明，0.5mg/L戊唑醇会导致斑马鱼氧化损伤，氧化应激模型建立成功。图4不同组别斑马鱼自发行为轨迹注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著;**与空白组相比，p<0.01，差异显著图5不同组别斑马鱼自发行为参数谷胱甘肽含量标准曲线：如图6所示，最佳实验条件下，GSH的浓度在至0µmol/L-100µmol/L范围内与OD值呈现良好的线性关系，GSH回归方程为：y=0.0037x-0.0011，纵坐标为OD值，横坐标为谷胱甘肽浓度（µmol/L），r=0.9987。图6GSH标准曲线多巴胺含量标准曲线：如图7所示，实验最佳条件下，在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中调节扫描速率为10mv/s，从-0.4v-0.6v之间进行扫描，多巴胺的浓度在至1µg/L-3µg/L范围内与峰电流呈现良好的线性关系(如图6)，回归方程为：y=1.2842x-0.53623，纵坐标为多巴胺浓度，单位为µg/L，横坐标为峰电流大小，单位为A。相关系数r=0.9956。图7多巴胺浓度与峰电流关系以及标准曲线4.3总氧杂蒽酮对斑马鱼氧化损伤的的修复作用4.3.1斑马鱼肝组织谷胱甘肽的含量测定将斑马鱼解剖后，将肝组织按照“3.3.3斑马鱼肝脏组织谷胱甘肽的含量测定”方法检测，由图8所示，模型组斑马鱼肝组织的GSH质量/肝重量（mg/100g）相较空白组下降34.9%，不同剂量的给药组相较模型组分别上升12.1%、23.1%和49.8%。结果表明，戊唑醇导致斑马鱼氧化损伤，总氧杂蒽酮会起到对氧化损伤的修复作用。注：**与空白组相比，p<0.01，差异显著；***与空白组相比，p<0.001，差异极显著；ns与空白组相比，p>0.05图8不同组斑马鱼体内谷胱甘肽含量4.4.2斑马鱼的运动行为学观察空白组、模型组、DMSO组、低剂量组、中剂量组和高剂量组斑马鱼2min内运动轨迹和运动参数如图9-11所示。模型组的斑马鱼更喜爱中央区域游动，活跃性较高；而给药组则相对安静，活跃性较低。由图中可知，模型组运动距离最长，且其运动距离显著高于空白组，给药组运动距离与空白组无明显差距；模型组静止时间最短，显著低于空白组，而给药组的静止时间与空白组相比无明显差异，说明总氧杂蒽酮对氧化应激有明显修复作用。结果表明，正常组的斑马鱼活动规律正常，匀速平缓在观察孔中游动，模型组斑马鱼运动行为增强，给予总氧杂蒽酮则会使斑马鱼行为恢复。另外，DMSO组与正常组无明显差异，可以认为溶剂毒性不会影响实验结果。注：a.空白组；b.模型组；c.DMSO组；d.低剂量组；e.中剂量组；f.高剂量组图9不同组别斑马鱼自发行为轨迹注：**与空白组相比，p<0.01，差异显著；ns与空白组相比，p>0.05图10不同组别斑马鱼的静止时间注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著；ns与空白组相比，p>0.05图10不同组别斑马鱼的游动距离4.4.3斑马鱼脑组织多巴胺含量计算将斑马鱼解剖后，将脑组织按照“3.5斑马鱼神经系统的毒性检测”方法检测，结果如图12所示。由数据可知，模型组相较于正常组多巴胺含量的提高8.1%，给药后多巴胺含量基本恢复至空白组水平。给药后多巴胺浓度得以恢复，说明给药可以修复其氧化损伤作用；另外，DMSO组与正常组无明显差异，可以认为溶剂毒性不会影响实验结果。注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著；ns与空白组相比，p>0.05图11不同组别斑马鱼脑组织DA含量

5小结本文探究了山竹壳中总氧杂蒽酮的提取工艺优化，并考察其对氧化损伤的修复作用。采用单因素法得到山竹壳总氧杂蒽酮的最优条件为提取时间为1.5h、料液比1：60g/mL、提取温度50℃、乙醇体积分数80%为最佳条件。总氧杂蒽酮对氧化损伤有显著的修复作用：给药组的斑马鱼肝组织中谷胱甘肽含量均低于正常组，高于模型组；斑马鱼脑组织中模型组的多巴胺含量略高于正常组，经过给药处理后，行为学参数和脑组织中DA含量基本恢复至正常水平。通过优化山竹壳总氧杂蒽酮的提取条件，可探索更高效、经济的提取技术；总氧杂蒽酮通过优越的抗氧化作用与神经保护作用实现对氧化损伤的修复，有望作为膳食补充剂应用于器官氧化损伤及阿尔兹海默症等神经疾病的治疗。

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