去乙酰毛花苷的杂质分析与测定

[21]。基于去乙酰毛花苷生产过程中使用到的生产设备、起始原料、物料和直接接触包装材料的元素杂质含量分析，基于ICHQ3D指导原则，去乙酰毛花苷中元素杂质含量不足以对制剂构成风险。早期毛花毛地黄苷C提取和精制时引入的残留溶剂可通过有关物质中毛花毛地黄苷C的检查进行控制。综上，本次研究课题主要分析的杂质来源为：一是提取分离过程残留的糖苷和各种糖苷的降解产物地高辛、吉妥辛、洋地黄毒苷等，此类杂质采用液相色谱法进行有关物质测定；二是去乙酰毛花苷重结晶时引入的残留溶剂，主要为甲醇和二氯甲烷，采用气相色谱法进行残留溶剂测定。2.1实验仪器和试剂2.1.1实验仪器表2-1仪器名称及厂家仪器名称仪器厂家Agilent1260高效液相色谱仪，紫外检测器美国安捷伦科技有限公司XPE56微量分析天平梅特勒7890A气相色谱仪，火焰离子化检测器美国安捷伦科技有限公司XS105DualRange电子天平梅特勒7890A气相色谱仪，电子捕获检测器美国安捷伦科技有限公司2.1.2实验耗材表2-2实验耗材及厂家实验耗材耗材厂家十八烷基硅烷键合硅胶柱（4.6mm×250mm，5μm）Kromasil6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱（30m×0.53mm，膜厚3.0µm）Phenomenex2.1.3实验试剂表2-2实验试剂及厂家实验试剂试剂厂家纯化水广州市药检所超纯水仪乙腈康科德科技有限公司甲醇康科德科技有限公司去乙酰毛花苷对照品企业提供毛花毛地黄甘C企业提供甲醇对照品中国食品药品检定研究院二氯甲烷对照品中国食品药品检定研究院三氯甲烷对照品中国食品药品检定研究院二甲亚砜默克2.2实验方法2.2.1HPLC法测定去乙酰毛花苷有关物质采用高效液相色谱法测定去乙酰毛花苷有关物质，梯度洗脱，毛花毛地黄苷C和未知杂质计算采用不加校正因子的主成分自身对照法计算。精密称取去乙酰毛花苷200mg，加甲醇10ml，超声使溶解，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀释至100ml，摇匀，作为有关物质供试品溶液。精密量取有关物质供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀释至刻度，摇匀，作为有关物质对照溶液。精密量取对照溶液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液。精密称取毛花毛地黄苷C20mg，置100ml量瓶中，加甲醇10ml，超声使溶解，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀释至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀释至刻度，摇匀，作为毛花毛地黄苷C对照品溶液。色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6mm×250mm，5μm）；以水为流动相A；以乙腈-甲醇（22：14）为流动相B；按下表进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；检测波长为220nm；进样体积20μl。表2-4梯度洗脱条件时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）02021454651626248486262383852523838精密量取供试品溶液、对照溶液、灵敏度溶液和毛花毛地黄苷C对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。2.2.2GC法测定去乙酰毛花苷中甲醇采用气相色谱法，Agilent7890A气相色谱仪，火焰离子化检测器，AgilentG1888顶空进样器，程序升温，顶空进样，按外标法计算甲醇残留量。精密称取去乙酰毛花苷100mg，置顶空瓶中，精密加入二甲亚砜2.5ml使溶解，密封，作为残留溶剂供试品溶液。精密称取甲醇对照品125mg，置50ml量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置顶空瓶中，密封，作为甲醇对照品溶液。色谱条件：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱（30m×0.53mm，膜厚3.0µm）；起始温度为35℃，维持10分钟，以每分钟10℃的速率升温至150℃，再以每分钟60℃的速率升温至230℃，维持10分钟；进样口温度为250℃；检测器为氢离子火焰检测器，温度为300℃；顶空瓶平衡温度为60℃，平衡时间20分钟；载气为氮气，流速为每秒25cm，分流比为4：1。进样体积为1ml。取残留溶剂供试品溶液和甲醇对照品溶液分别顶空进样，记录色谱图。2.2.3GC法测定去乙酰毛花苷中二氯甲烷采用气相色谱法，Agilent7890A气相色谱仪，电子捕获检测器，AgilentG1888顶空进样器，程序升温，顶空进样，按外标法计算二氯甲烷残留量。精密称取去乙酰毛花苷100mg，置顶空瓶中，精密加入二甲亚砜2.5ml使溶解，密封，作为残留溶剂供试品溶液。精密称取二氯甲烷对照品160mg，置100ml量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置顶空瓶中，密封，作为二氯甲烷对照品溶液。精密称取三氯甲烷对照品250mg，置100ml量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，作为三氯甲烷储备溶液。精密量取二氯甲烷对照品溶液10ml和三氯甲烷储备液1ml，置100ml量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置顶空瓶中，密封，作为系统适用性溶液。色谱条件：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱（30m×0.53mm，膜厚3.0µm）；起始温度为35℃，维持10分钟，以每分钟10℃的速率升温至150℃，再以每分钟60℃的速率升温至230℃，维持10分钟；进样口温度为250℃；检测器为离子捕获检测器，温度为300℃；顶空瓶平衡温度为60℃，平衡时间20分钟；载气为氮气，流速为每秒25cm，分流比为4：1。进样体积为1ml。取残留溶剂供试品溶液、二氯甲烷对照品溶液和系统适用性溶液分别顶空进样，记录色谱图。3结果与讨论3.1HPLC法测定去乙酰毛花苷有关物质结果与方法学验证3.1.1专属性考察按2.2.1色谱条件，依次记录供试品溶液、空白、对照溶液和毛花毛地黄苷C对照品溶液液相色谱图，溶剂对去乙酰毛花苷、毛花毛地黄苷C和其他杂质均无干扰，且供试品溶液中主峰和杂质之间均能有效分离。供试品溶液中各杂质峰名称见表3-1，色谱图见图3-1、图3-2、图3-3和图3-4。表3-1供试品溶液中杂质峰名称名称保留时间（min）相对保留时间分离度未知杂质12.4520.23--地高辛配基5.5090.5313.4未知杂质26.3650.613.8未知杂质37.7450.745.1未知杂质49.5340.914.4去乙酰毛花苷10.4611.001.9未知杂质511.6611.112.8未知杂质613.1431.262.5未知杂质721.7252.0811.2地高辛23.8852.283.9未知杂质824.7832.373.6未知杂质925.1962.412.1洋地黄毒苷配基27.8502.6610.6吉妥辛37.6853.6021.3图3-1供试品溶液色谱图图3-2空白溶液色谱图图3-3对照溶液色谱图去乙酰毛花苷：10.512min图3-4毛花毛地黄苷C对照品溶液色谱图毛花毛地黄苷C：22.581min3.1.2线性范围与校正因子以浓度C（μg/ml）为横坐标，峰面积A为纵坐标，分别进行去乙酰毛花苷、毛花毛地黄苷C、地高辛和吉妥辛的回归分析，四个成分线性图见图3-5，线性回归方程和相对校正因子见表3-2。图3-5四个组分线性图表3-2四个组分的线性回归方程组分线性范围（μg/ml）线性方程相关系数R相对校正因子去乙酰毛花苷4.9～49A=19091C+20740.99991.00毛花毛地黄苷C4.6～46A=18143C-25900.99990.95地高辛4.9～49A=19253C-49130.99971.01吉妥辛5.0～50A=19827C+56690.99991.04注：表3-6中相对校正因子为组分线性方程的斜率与去乙酰毛花苷线性方程斜率的比值。由上述结果可得出结论，毛花毛地黄苷C、地高辛和吉妥辛相对去乙酰毛花苷的校正因子在0.95～1.05之间，进行三个杂质的定量计算时，可不加校正因子计算去乙酰毛花苷峰面积计算。3.1.3其他方法学考察为确认拟定有关物质检查方法，能够检出杂质的最低浓度，本次课题同时验证了检出限和定量限，同时为拟定方法灵敏度溶液的制备方法提供依据。检出限和定量限结果见表3-3。表3-3去乙酰毛花苷检出限和定量限检查项目去乙酰毛花苷检出限S/N=30.02μg/ml0.001%定量限S/N=100.07μg/ml0.003%取供试品溶液，置20℃阴凉处保存，分别在0、1、2、4、8、12和24小时注入液相色谱仪，记录色谱图，各杂质峰分离度良好，检出数量和检出杂质的含量均无明显变化。供试品溶液（20℃保存）24小时内稳定。表3-4有关物质供试品溶液稳定性杂质0h1h2h4h8h12h24h杂质14776463046824693430942484417杂质23919404342364316432444814598杂质310563104931044310443105321057010526杂质49708955992069179911091899141杂质55107497751544867501646504769杂质64320454745454476450645414526杂质77944677967476928703762267081杂质89852979398709893975399349933杂质96206624764786662639368896713杂质10739833961922926759981杂质1111510891239038901889087138581杂质1239303717400o3802389937863841杂质13159241614616044166901571315764160243.1.4有关物质结果三批样品的有关物质结果见表3-5。表3-5有关物质结果批号毛花毛地黄苷C地高辛（%）吉妥辛（%）其他最大单个杂质（%）杂质总量（%）1未检出0.020.040.030.242未检出0.010.040.030.223未检出0.010.040.050.243.2GC法测定去乙酰毛花苷中甲醇和二氯甲烷结果与方法学验证本次研究中，除甲醇采用氢离子火焰检测器，二氯甲烷同时用氢离子火焰检测器和电子捕获检测器考察拟定方法外，均采用同一色谱条件，程序升温，顶空进样，测定甲醇和二氯甲烷的残留量。3.2.1线性回归方程以浓度C（μg/ml）为横坐标，峰面积A为纵坐标，分别进行甲醇（氢离子火焰检测器）、二氯甲烷（氢离子火焰检测器）和二氯甲烷（电子捕获检测器）的回归分析，线性图见图3-6和图3-7，线性回归方程见表3-6。表3-6线形回归方程组分线性范围（μg/ml）线性方程相关系数R甲醇（FID）6.9～69A=0.5231C-0.13850.9996二氯甲烷（FID）4.4～44A=0.8204C+0.03420.9999二氯甲烷（ECD）4.9～49A=544.03C-209.750.9999图3-6甲醇（FID）线性图图3-7二氯甲烷（FID）与二氯甲烷（ECD）线性图由上述数据可知，二氯甲烷采用电子捕获检测器测定时，二氯甲烷响应值远高于采用氢离子火焰检测器记录时的响应值。

3.2.2加样回收试验本次课题验证准确度时采用加样回收试验，精密称取去乙酰毛花苷原料药50mg，精密加入甲醇（二氯甲烷）对照品溶液2.5ml，作为甲醇（二氯甲烷）的加样回收试验溶液。结果见表3-7。表3-7甲醇（FID）回收率试验结果（n=6）样品中含量（μg/ml）加入甲醇量（μg/ml）测得甲醇量（μg/ml）回收率（%）12.43222.95724.135105.112.40722.95723.919104.212.42222.95724.144105.212.41222.95723.642103.012.54422.95724.548106.912.34022.95723.720103.3表3-8二氯甲烷（FID）回收率试验结果（n=6）样品中含量（μg/ml）加入二氯甲烷量（μg/ml）测得二氯甲烷量（μg/ml）回收率（%）014.53014.25698.1014.53014.703101.2014.53014.544100.1014.53014.43199.3014.53014.968103.0014.53014.52299.9表3-9二氯甲烷（ECD）回收率试验结果（n=6）样品中含量（μg/ml）加入二氯甲烷量（μg/ml）测得二氯甲烷量（μg/ml）回收率（%）0.11815.53015.857109.10.11615.53015.704108.10.11615.53015.454106.40.11615.53016.485113.50.11515.53015.795108.70.11515.53016.435113.13.2.3其他方法学验证本课题同时验证了检出限和定量限。检出限和定量限结果见表3-10。表3-10去乙酰毛花苷残留溶剂检出限和定量限检查项目甲醇（FID）二氯甲烷（FID）二氯甲烷（ECD）检出限S/N=30.6μg/ml0.0015%0.7μg/ml0.0018%0.03μg/ml0.00008%定量限S/N=102.0μg/ml0.005%2.4μg/ml0.006%0.1μg/ml0.00025%4小结当建立一种新的分析方法时，方法学研究非常重要。本研究对去乙酰毛花苷杂质分析方法展开了系统的方法学研究，主要包括专属性、线性、检测限，重复性等方面的验证。专属性是指测定物质与其他物质的反应性差异性能，该验证结果表明本方法能够有效地检测出去乙酰毛花苷中潜在的杂质。线性是指测定方法的灵敏度随样品中分析物含量增加而增加的能力，该验证结果表明本方法在一定浓度范围内具有较好的线性关系。检测限是指检测方法能够可靠地检测到去乙酰毛花苷有关物质以及残留溶剂存在的最低浓度，该验证结果表明本方法具有较低的检测限。重复性指的是，在同样的实验条件下，对同一批去乙酰毛花苷进行多次分析后，得出的结果具有一致性。该验证结果表明本方法的重复性好，具有较高的准确性和精确度。4.1有关物质测定的小结在分析方法建立过程中，色谱参数的选择对分析结果有着至关重要的影响。本研究通过多次试验，确定了相应的色谱参数。具体而言，选择了C18色谱柱，并采用流动相为甲醇乙腈和水，使用梯度洗脱程序，以保证测定的灵敏度和准确度。在最终的优化方法中，本研究采用了不加校正因子的自身对照法计算已知杂质（毛花毛地黄苷C）和未知杂质的含量。与传统的校正因子方法相比，该方法具有计算简单、结果准确的优点。本研究所建立的分析方法，相较于国外药典采用的薄层色谱法，具有更高的分析效率和准确性，同时对测定环境的要求也更低。因此，本方法可广泛应用于去乙酰毛花苷中杂质的分析，并有望成为行业标准的参考方法。在今后的研究中，还可将本方法应用于去乙酰毛花苷质量的分析，以实现更加准确和全面的分析结果。综上，本研究通过优化有关物质测定方法，建立了一种高效、准确的去乙酰毛花苷中杂质的分析方法。本方法在方法学研究、色谱参数优化以及自身对照法计算方法等方面的验证表明，该方法具有良好的专属性、线性、检测限和重复性等验证项目，可有效地检出去乙酰毛花苷中的潜在杂质。在今后的应用中，需要进一步考虑方法的应用范围和实际情况，结合具体的实验需求和环境条件进行优化和改进。另外，本方法虽然能够有效检测出去乙酰毛花苷中的潜在杂质，但并不保证检测出所有的杂质，因此，在实际应用中需要注意对杂质的筛查和分析。综上所述，本研究所建立的分析方法能够可靠、准确地检测出去乙酰毛花苷中的潜在杂质，具有较高的分析效率和准确性，可作为行业标准的参考方法。随着科学技术的不断进步和实验方法的不断优化，相信该方法在去乙酰毛花苷的分析和控制方面会有更加广泛的应用和推广。4.2残留溶剂测定的小结国内外药典中均未制定有机残留溶剂的测定方法，其合成路线和精制过程均需使用有机溶剂，这些残留的有机溶剂对人体的危害十分巨大，因此有机溶剂残留量的测定方法研究更有利于今后去乙酰毛花苷原料药质量的的控制和提高。本次研究旨在建立一种准确、可靠的方法，用于检测去乙酰毛花苷中残留的有机溶剂含量。由于国内外药典中尚未制定有机残留溶剂的测定方法，因此该研究的意义十分重大。本次研究采用GC法来测定有机溶剂的含量，验证了该方法的可行性。在本次研究中，我们通过评估该方法的专属性、线性、检测限和回收率等验证项目，证明了该方法的可靠性和准确性。我们采用气相色谱法，程序升温，顶空进样，并按外标法计算甲醇残留量。该方法测定含量数据准确且通用，可以用于去乙酰毛花苷原料药的有机溶剂残留量的测定。但是，值得注意的是，本次研究仅针对常见的有机溶剂进行了测定，对于其他有机溶剂的检测还需要进一步的研究。此外，由于不同厂家在合成去乙酰毛花苷时使用的有机溶剂种类和用量可能存在差异，因此需要对不同来源的去乙酰毛花苷进行定制化的检测方法。综上所述，本次研究建立了一种准确、可靠的方法，用于检测去乙酰毛花苷中残留的有机溶剂含量。该方法可用于去乙酰毛花苷原料药质量的控制和提高，并有望成为行业标准的参考方法。未来，我们将进一步完善该方法，开展更为广泛的实验，以提高该方法的适用性和可靠性。参考文献李晓.硝普钠联合去乙酰毛花苷治疗急性左心衰肺水肿的效果观察[J].临床医学,2022,(06):84-86.刘艳辉;范永会;王建文.门冬氨酸钾镁联合去乙酰毛花苷治疗重症心力衰竭的临床研究[J].现代药物与临床,2022,(08):1764-1768.RaoZ,QinH,WeiY,etal.DevelopmentofadynamicmultiplereactionmonitoringmethodfordeterminationofdigoxinandsixactivecomponentsofGinkgobilobaleafextractinratplasma[J].JournalofChromatographyB,2014,959:27-35.KlysM,GrossA.Determinationofdeslanosideinantemortemandpostmortemspecimens.Unusualcasereport[J].Forensicscienceinternational,1990,45(3):231-238.AbadyMM,JeongJS,KwonHJ.Developmentandvalidationofananalyticalmethodusingliquidchromatography-tandemmassspectrometryforthetherapeuticdrugmonitoringofsevencardiovasculardrugsinclinicalusage[J].JournalofChromatographyB,2023,1214:123552.高睿;刘慧颖;王福鑫.顶空气相色谱法测定氨磷汀的残留溶剂[J].品牌与标准化,2023,(02):119-121.邓双炳;方礼;刘芳芳;徐滢;王章伟;刘地发.顶空-气相色谱法测定枳实总黄酮提取物中的树脂残留和溶剂残留[J].理化检验-化学分册,2023,(03):360-363.朱蔚华;吕瑞绵;胡秋;王慕邹;章观德.毛花洋地黄栽培群体的类型及其初步选择[J].中草药,1980,11(05):223-226.陈小林,王刚,梁屹,杨易可,张帆,占娅锋,高鹏飞,毛亮.(2022).一种去乙酰毛花苷及杂质的制备方法:中国,201910813524.5.[P].2022-10-04.刘艳辉;范永会;王建文.门冬氨酸钾镁联合去乙酰毛花苷治疗重症心力衰竭的临床研究[J].现代药物与临床,2022,(08):1764-1768.黄浩喜