大黄的检查及含量测定

大黄的检查及含量测定【摘要】目的：对随机抽取的10批大黄药材进行各项针对性检查及其中土大黄苷含量的测定，为大黄药材的质量控制提供参考。方法：参照2020年版《中国药典》中的方法及步骤对10批随机抽取的大黄药材进行水分、总灰分、水溶性浸出物、二氧化硫残留量检查，含量测定等检查。对实验结果进行RSD等分析处理，通过比较这10批大黄的总蒽醌及游离蒽醌等含量，评价大黄的质量优劣。结果：10批大黄的薄层鉴别所显示的斑点，跟其对照药材、大黄酸对照品溶液的薄层色谱图出现在一样的位置上，其中大黄药材的薄层色谱图中没有出现土大黄苷成分的斑点；水分测定结果为6.02%～8.71%，计算所得平均值结果为7.00%；总灰分检查结果为3.37%～8.91%，平均值为5.39%水溶性浸出物结果为33.53%～49.31%，平均值42.11%；二氧化硫残留量测定结果为0~7.35mg/kg，平均值为2.10mg/kg；总蒽醌含量测定结果为1.23%~2.13%平均值为1.76%；游离蒽醌含量测定结果为0.32%~1.58%平均值为0.94%。结论：本实验对大黄进行的各种检查，包括水分检查、总灰分检查、水溶性浸出物检查、二氧化硫残留量检查及含量测定，除批号为YPA7D0002的大黄样品总蒽醌含量不达标，其余批次大黄样品均符合2020年版《中国药典》中规定，可初步推断这10批随机抽取的大黄药材为质量较优的正品。【关键词】大黄；土大黄苷；总蒽醌；检查；含量测定

InspectionanddeterminationofRhubarb[Abstract]Objective:Thetargetedexaminationof10batchesofrhubarbmedicinalmaterialsrandomlyselectedandthedeterminationofthecontentofrhaponticinwerecarriedout,whichprovidedareferenceforthequalitycontrolofrhubarbmedicinalmaterials.Methods:Accordingtothemethodsandstepsinthe2020editionoftheChinesePharmacopoeia,themoisture,totalash,water-solubleextract,sulfurdioxideresidueandcontentdeterminationof10batchesofrhubarbwereexamined.TheexperimentalresultswereanalyzedbyRSD,andthequalityofrhubarbwasobtainedbycomparingthecontentsoftotalanthraquinoneandfreeanthraquinoneinthe10batchesofrhubarb.Results:TheTLCidentificationof10batchesofrhubarbshowedthesamecolorspotsinthesamepositionasthereferencemedicinalmaterialsandrheinreferencesolution,anddidnotshowthesamecolorspotsinthesamepositionasthereferencesolutionofrhaponticin.Theresultsofmoisturedeterminationwere6.02%~8.71%,withanaverageof7.00%.Thetotalashcontentwas3.37%~8.91%,withanaverageof5.39%.Theresultsofwater-solubleextractwere33.53%~49.31%,withanaverageof42.11%.Thedeterminationresultsofsulfurdioxideresiduewere0~7.35mg/kg,withanaverageof2.10mg/kg.Thetotalanthraquinonecontentwas1.23%~2.13%,withanaverageof1.76%.Thecontentoffreeanthraquinonewas0.32%~1.58%,withanaverageof0.94%.Conclusion:Inthisexperiment,variousinspectionsofrhubarbwerecarriedout,includingmoistureinspection,totalashinspection,water-solubleextractinspection,sulfurdioxideresidueinspectionandcontentdetermination.ExceptthatthetotalanthraquinonecontentoftherhubarbsamplewithbatchnumberYPA7D0002wasnotuptostandard,theotherbatchesofrhubarbsampleswereinlinewiththeprovisionsofthe2020editionofthe'ChinesePharmacopoeia'.Itcanbepreliminarilyinferredthatthese10batchesofrandomlyselectedrhubarbmedicinalmaterialsareauthenticwithbetterquality.[Keywords]RhubarbEarthrhubarbglycosidesTotalanthraquinoneInspectionDetermination目录 TOC\o"1-3"\u1前言 前言大黄为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.exBalf.或药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根和根茎[1]。大黄始载于东汉时期的《神农本草经》[2]，《吴普本草》对其释言道：“生蜀郡北部或陇西。二月卷生黄赤，其叶四四相当，茎高三尺许。三月花黄，五月实黑，八月采根。根有黄汁，切片阴干。[3]”又陶弘景释其名曰：“大黄，其色也。将军之号。当取其骏快也。[4]”故大黄又得将军之号。大黄药味苦、药性寒，归脾经、胃经、大肠经、肝经、心包经，具有清热泻火、利湿退黄、泻下等功效，内服常用于治疗实热积滞便秘，湿热痢疾、水肿等，而外用可治烧烫伤，具有悠久的入药历史。据史书记载，西汉初大黄已被大批量销往欧洲，成为中国主要出口的中药材之一[5]，由此足以显示大黄其功效之优。大黄的主要活性成分及主要药用成分为蒽醌类成分，大量临床试验表明其具有预防和治疗急性肝损伤的作用[6]，同时，其显著的抗炎特性使其在中国已被用作强收敛剂，在临床上广泛应用于治疗炎症相关疾病[7]。除此，来自大黄的蒽醌类成分，还可作为阿尔茨海默病（AD）三甲胺（TMA）裂解酶的潜在抑制剂，用于预防和治疗AD[8]，并可改善肠道屏障，调节肠道微生物紊乱[9]。随着大黄的药效在临床应用中愈加凸显，其需求量随之增大，导致在原药材的选择会因药用资源的匮乏而选用其它的代用品，导致其中药用成分的含量会因不同来源或不同栽培方式而有所不同[10]，这就在一定程度上制约了以大黄为主要原料的制剂或方剂的质量。为此，现行的2020年版《中国药典》也指定了包括水分、灰分、浸出物、总蒽醌含量、游离蒽醌含量等作为其定量质量和控制指标[11]，由此可见，为保证大黄临床运用的安全性和有效性，对其进行各项检查和质量评价具有重要的研究意义。为了解市面上大黄药材的质量情况，本课题研究随机选取了10批由广州市药材公司中药饮片厂购进的大黄药材进行土大黄苷的薄层鉴别、水分检查、总灰分检查、浸出物检查及总蒽醌、游离蒽醌含量测定。同时，考虑到中药材及饮片的加工贮藏过程普遍存在以硫磺熏蒸达到干燥、防虫、防腐和防霉变等作用的现象[12]，本课题实验还开展了大黄中二氧化硫的残留量检查。最终综合各考察因素的结果，分析各批次药材的质量优劣，为大黄的质量控制提供参考。

2材料与方法2.1材料.1.1仪器本实验所使用仪器如下表1。表1实验仪器名称型号生产公司万分之一电子天平BSA224S-CW广州授科仪器科技有限公司数控超声波清洗器KQ-300DA昆山超声仪器有限公司高速多功能粉碎机RHP-100浙江永康荣浩工贸有限公司调速多用振荡器HY-2江苏金坛市环宇科学仪器厂数显恒温水浴锅HH-6常州澳华仪器有限公司数显鼓风恒温干燥箱GZX-9070MBE上海博迅实业有限公司医疗设备厂百万分-微量分析天平BM-20广州市锦泉仪器科技有限公司套式恒温器TC-15海宁市新华医疗器械厂高效液相色谱仪UltiMate3000美国戴安公司电阻炉温度控制器KSW余姚金电仪表有限公司磁力加热搅拌器79-1常州澳华仪器有限公司原子吸收分光光度计AA-7000日本岛津公司.1.2试剂本实验所使用仪器如下表2。表2实验试剂名称生产公司甲醇（AR）广州化学试剂厂甲酸（AR）广州化学试剂厂石油醚（30~60℃）广州化学试剂厂甲酸乙酯（AR）广州化学试剂厂甲苯（AR）广州化学试剂厂丙酮（AR）广州化学试剂厂磷酸（AR）广州化学试剂厂乙腈（色谱纯）美国Fisher公司甲醇（色谱纯）美国Fisher公司蒸馏水屈臣氏商标有限公司.1.3试药本实验所使用对照品试药如下表3。表3实验药材样品信息名称生产公司/机构批号土大黄苷对照品中国药品生物制品检定研究院110794-201607芦荟大黄素对照品中国药品生物制品检定研究院110785-201710大黄酸对照品中国药品生物制品检定研究院110757-201607大黄素对照品中国药品生物制品检定研究院110756-201512大黄酚对照品中国药品生物制品检定研究院110796-201118大黄素甲醚对照品中国药品生物制品检定研究院110758-2016162.1.4大黄药材信息本实验所使用大黄药材由广州市药材公司中药饮片厂提供，样品信息如下表4。表4大黄药材信息编号批号1YPA7D00012YPA7D00023YPA7D00034YPA7D00045YPA7D00056YPA7D00067YPA7D00078YPA7D00089YPA7D000910YPA7D00010

2.2方法2.2.1薄层鉴别及土大黄苷的检查用称量舟精密地称量1毫克大黄酸的对照品，用吸管少量多次吸取甲醇溶液冲洗称量舟中的对照品，使其溶解到规格为1毫升的容量瓶中，再取一支2毫升注射器，针头装入带有0.45微米微孔滤膜的进样头，将配置好的对照品储备液倒入少量至此注射器，将溶液打进1.5毫升进样小瓶中，作为大黄酸的对照品溶液；同法，可得到浓度为每毫升十微克的土大黄苷对照品储备液。其中土大黄苷对照品储备液需现配现用。薄层鉴别操作方法：取本品粉末0.1克置规格为50毫升的锥形瓶中，加入甲醇20毫升，封上封口膜，锥形瓶中的溶液首先要在常温下冷浸1小时，然后用干燥的漏斗过滤，用5毫升移液管吸取滤液到蒸发皿上，打开水浴锅调节温度为100℃，把蒸发皿放到水浴锅上，蒸干溶液后，可得到残渣，再往其中以10毫升的水进行复溶，残渣溶解完全的溶液转移至锥形瓶中，加入1毫升盐酸溶液后，水浴锅中回流30分钟，进行酸性条件的水解，30分钟后立即取出，待锥形瓶中的溶液冷却后，把溶液完全转移到分液漏斗，以每次20毫升乙醚的用量，振摇萃取溶液两次，合并乙醚层的溶液至蒸发皿上，把蒸发皿放到水浴锅上，利用水蒸气热量把溶液蒸干，可得到残渣，再往其中加入1毫升氯仿复溶，经0.45微米微孔滤膜过滤即可得到供试品储备液。同法可把0.1克大黄的对照药材，制成大黄的对照药材储备液。用规格为4微升的毛细管分别吸取以上三种储备液，对应点于同一块硅胶H薄层板上，此板以CMC-Na为黏合剂，将1毫升甲酸、5毫升甲酸乙酯、15毫升石油醚（30～60℃）混合均匀，静置一段时间，取上层溶液作为展开剂。先在展开缸中一侧加入一定量的展开剂，密封保持20分钟。待溶剂蒸气饱和后，应马上把已完成点样的硅胶H薄层板放入其中，注意展开剂不与点样位置接触，立即密闭展开缸，使其充分展开，观察到展开剂前沿已超过标记的前沿线时，取出硅胶H薄层板，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，观察硅胶H薄层板显色情况。以浓氨水为显色剂，均匀喷于薄层板上，观察其熏氨后的显色情况。土大黄苷检查操作方法：取本品0.1克粉末置规格为50毫升的锥形瓶中，加入10毫升甲醇溶液，封上封口膜，然后在20分钟的超声提取后，把锥形瓶从超声仪中取出，用干燥的漏斗过滤，用1毫升移液管吸取滤液至10毫升容量瓶中，以甲醇为溶剂定容，即可得到供试品溶液。用规格为5微升的毛细管吸取样品溶液及土大黄苷储备液，对应点于同一块无需活化的聚酰胺薄膜上，将3毫升甲苯、2毫升甲醇、0.5毫升甲酸乙酯、0.01毫升甲酸、0.5毫升丙酮混合均匀，作为展开剂。载有供试品的聚酰胺薄膜的展开同薄层鉴别操作方法中的展开操作，氨熏操作除外。2.2.2水分检查按照《中国药典》2020年版四部中通则0832的水分测定法烘干法（第二法），测定样品为10批大黄药材样品，每批样品进行3个平行样测定。取已恒重的扁形称量瓶，用减重称量法在万分之一天平上称取2克大黄药材样品，开启瓶盖，把烘箱温度调至105摄氏度，把扁形瓶放入其中进行5小时的干燥操作后，盖好瓶盖，迅速把称量瓶取出，移置放有预先干燥好的硅胶珠的干燥器中，放冷30分钟后，将称物瓶取出，迅速称定，称定后在以上温度下继续进行1小时干燥，然后转移至同一干燥器中冷却约30分钟，再次精确地称定，直至前后两次连续称量样品重量的差异≤5毫克即可判定为实验终点。由式：含水量（%）=样品失去的重量-样品的称样量2.2.3总灰分检查按照《中国药典》2020年版四部中通则2302的总灰分测定法，测定样品为10批大黄药材样品，每批样品进行3个平行样的测定。取已恒重的坩埚，用减重称量法在万分之一天平上称取4克过二号筛的大黄药材粉末，平铺于恒重后的坩埚中，半合盖子在电陶炉上慢慢炽热，直至完全炭化没有出现白色烟雾，迅速放入已提前600摄氏度恒温的马弗炉中，炽灼5小时后关闭马弗炉，稍打开马弗炉门，待马弗炉中温度下降至200摄氏度，将坩埚盖上盖子，马上转移至预先干燥好的硅胶珠的干燥器中使之冷却，迅速精密地称量，再将坩埚盖半开放入马弗炉600摄氏度炽灼1小时，重复降温步骤，迅速精密称定重量；注意若不恒重，则继续操作上述步骤直至灰烬恒重。根据称定坩埚中残渣的重量，以干燥品计算10批大黄药材中总灰分的含量（%）。2.2.4二氧化硫残留量检查按照《中国药典》2020年版四部中通则2331项下的二氧化硫残留量测定法的酸碱滴定法（第一法），测定样品为10批大黄药材样品，每批样品进行3个平行样的测定。在万分之一天平上称定约10克大黄药材，倒入容量为2升的两颈圆底烧瓶，加入溶剂为350毫升水。在两颈圆底烧瓶中间瓶口处连接一根竖式回流冷凝管，然后打开冷凝水开关。把冷凝管上端的二氧化硫导出口连接一条橡胶管，其末端需伸至装有50毫升3%H2O2溶液的锥形瓶底部，其氧化性可使其用作二氧化硫的吸收液。在开始实验前，需往二氧化硫吸收液中加入3滴此实验酸碱滴定的指示剂，即浓度为2.5mg/ml的甲基红乙醇溶液，并用0.01mol/L的氢氧化钠溶液进行空白的校正，滴定终点时溶液应呈黄色。开始实验前，可通过气体流量计使氮气以每分钟约0.2升的流速流通。两颈圆底烧瓶侧瓶口连接装有10毫升浓度为6mol/L的盐酸溶液的分液漏斗，打开活塞，使分液漏斗中的盐酸溶液迅速加入两颈烧瓶进行反应，立刻打开电热套开关，对蒸馏瓶进行加热，直至溶液沸腾，并在保持1.5小时的微沸后，停止对蒸馏瓶的加热。在实验过程中，溶液始终微沸，大黄样品中的亚硫酸盐物质在盐酸的处理下转化为二氧化硫，随后被氮气带出，导致吸收液变热，为了避免滴定的准确性，需彻底冷却后，再把装有吸收液的锥形瓶转移到磁力搅拌器上，利用转子的磁力使之不断被搅拌，用浓度为0.01mol/L氢氧化钠溶液进行二氧化硫的滴定，直至指示剂呈黄色，此时若指示剂持续20秒不褪色，则达到滴定终点，随后再将最终滴定的读数以实验前的空白试验进行校正。按以下公式计算:大黄样品的二氧化硫残留量（式中：A为大黄样品溶液消耗NaOH（aq）体积，ml；B为空白消耗NaOH（aq）体积，ml；c为NaOH（aq）的摩尔浓度，mol/L；0.032为1ml浓度为1mol/L的NaOH（aq）相当的SO2的质量，g；W为大黄样品的重量，g。将消耗的NaOH溶液体积代入上式计算，可分别计算得到10批大黄药材中二氧化硫的残留量（%）。2.2.5浸出物检查按照《中国药典》2020年版四部中通则2201的热浸法进行水溶性浸出物的检查，测定样品为10批大黄药材样品，每批样品进行3个平行样测定。用减重称量法在万分之一天平上称取2克过二号筛的大黄药材粉末，倒入规格为250毫升的锥形瓶中，加入溶剂为100毫升水，盖上塞子并封上封口膜，称定重量，锥形瓶中的溶液首先要在常温下冷浸1小时，随后连接蛇形冷凝管，打开冷凝水开关，调节水浴锅温度，使溶液沸腾，并保持锥形瓶中溶液1小时微沸。1小时后，把锥形瓶从水浴锅中取出，盖上塞子，待锥形瓶中液体彻底放冷后，再放到天平秤上称定重量，用水进行补重，充分摇晃均匀后，用干燥漏斗滤过，用25毫升移液管移取滤液至已恒重的蒸发皿上，调整水浴锅温度为100摄氏度，把蒸发皿内溶剂蒸干后，转移至已稳定于105摄氏度的烘箱内进行3小时干燥过程，然后取出装有浸出物的蒸发皿，转移至放有预先干燥好的硅胶珠的干燥器中，30分钟后蒸发皿及样品冷却，迅速在万分之一天平上称重。由式：浸出物含量%2.2.6含量测定2.2.6.1色谱条件本课题研究选择C-18色谱柱（250mm×4.5mm，5μm)，采用0.1%磷酸溶液-甲醇（15:85）流动相进行等度洗脱；检测波长为二百五十四纳米；流动相流动速度为每分钟一毫升；柱温箱温度为三十摄氏度；进样量为十微升；理论塔板数以大黄素峰计算应≥3000。2.2.6.2对照品溶液的制备称量舟精密称定大黄素甲醚对照品1毫克，用吸管少量多次吸取甲醇溶液冲洗称量舟中的对照品，溶解到25毫升容量瓶中，制成每1毫升含大黄素甲醚40微克的溶液；同时用微量天平称定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚对照品各1.6毫克，同法制成浓度均为80μg/ml的四份对照品储备液。分别用2微升移液管吸取上述对照品溶液混合到同一容量瓶中，得到每1毫升溶液中含8微克大黄素甲醚及含上述其余四种对照品各16微克的混合对照溶液。取一支5毫升注射器，针头装入带有0.45微米微孔滤膜的进样头，将配置好的对照品储备液倒入少量至此注射器，将溶液打进1.5毫升进样小瓶中，作为对照品溶液。2.2.6.3总蒽醌供试品溶液的制备采用减重称量法在万分之一天平上称取0.15克过四号筛的大黄药材粉末，倒入规格为250毫升的锥形瓶中，用25毫升移液管吸取甲醇试液到装有样品的锥形瓶中，盖紧塞子，放到天平秤上称定重量，调整水浴锅温度，再把锥形瓶放入其中进行加热回流，保持溶液微沸1小时后，迅速从水浴锅中取出锥形瓶，待锥形瓶内溶液自然晾凉后，再放到天平秤上称定重量，用甲醇试液进行补重，充分摇晃均匀后，用干燥漏斗滤过。用5毫升移液管移取所得续滤液到100毫升的具塞锥形瓶中，把锥形瓶敞开塞子放于通风橱，待甲醇完全挥去后，移取10毫升8%盐酸溶液到已挥干甲醇的锥形瓶中，盖上塞子，封上封口膜，放入超声仪（超声仪功率为250W），使溶液进行2分钟的超声提取，再往锥形瓶加入10毫升氯仿，调整水浴锅温度，再把锥形瓶放入其中进行加热回流，保持溶液微沸1小时后，迅速从水浴锅中取出锥形瓶，待锥形瓶内溶液自然晾凉后，转移100毫升锥形瓶中所有溶液到分液漏斗中，为保证成分不损失，再采用氯仿试液少量多次地洗涤锥形瓶，合并洗涤液，并转移到分液漏斗内，静置分层，缓慢旋动分液漏斗的活塞，使下层的氯仿萃取液流入圆底烧瓶中，再以每次10毫升氯仿的用量，对酸液进行三次萃取操作，合并所有氯仿萃取液，利用旋转蒸发仪减压回收圆底烧瓶内溶剂至干，往残渣加入适量甲醇试液复溶，并把复溶后的溶液吸到至规格为10毫升的容量瓶，以甲醇为溶剂进行定容，充分摇匀，取一支2毫升注射器，针头装入带有0.45微米微孔滤膜的进样头，将得到的样品溶液倒入少量至此注射器，将溶液打进1.5毫升进样小瓶中，作为总蒽醌供试品溶液。2.2.6.4游离蒽醌供试品溶液的制备采用减重称量法在万分之一天平上称取0.15克过四号筛的大黄药材粉末，倒入规格为250毫升的锥形瓶中，用25毫升移液管吸取甲醇试液到装有样品的锥形瓶中，盖紧塞子，放到天平秤上称定重量，调整水浴锅温度，再把锥形瓶放入其中进行加热回流，保持溶液微沸1小时后，迅速从水浴锅中取出锥形瓶，待锥形瓶内溶液自然晾凉后，再次放到天平秤上称定重量，用甲醇试液进行补重，充分摇晃均匀后，用干燥漏斗滤过。取一支2毫升注射器，针头装入带有0.45微米微孔滤膜的进样头，将得到的样品溶液倒入少量至此注射器，将溶液打进1.5毫升进样小瓶中，作为游离蒽醌供试品溶液。2.2.6.5测定法液相色谱仪设置对照品溶液、供试品溶液的进样量、流速、柱温、检测波长、梯度洗脱等相关参数，由自动进样器取样并注入液相色谱仪，测定，即得。2.2.7数据分析方法2.2.7.1主成分分析法主成分分析分析常选择实验结果中相关性较强的一些指标进行数据处理，最终构建出少数能替代原始数据的主成分，并进行后续分析。在本课题研究中，采用IBMSPSS25软件，将水分、总灰分、浸出物检查、总蒽醌含量测定及游离蒽醌含量测定这五项指标的数据进行标准化，消除五个变量指标量纲不同的影响后，再进行主成分分析，并通过相关公式计算，得出综合得分，并根据综合得分进行排名[8]。2.2.7.2系统聚类分析法系统聚类分析利用了分类的思想，以多个不同的考察指标为依据，对样品间的相似性进行分析，将特征相似的研究对象归为一类，使组内相似性最大化，组间差距最大化。在本课题研究中，选择对不同批次的大黄药材进行系统聚类分析，采用IBMSPSS25软件，以水分、总灰分、浸出物检查、总蒽醌含量测定及游离蒽醌含量测定为指标，将具有相似特征的大黄药材聚为一类，初步区分差异较大的大黄药材。

3结果与分析3.1大黄药材质量检测结果3.1.1薄层鉴别及土大黄苷的检查在365纳米波长下，可以看到大黄供试品薄层色谱中，有荧光斑点显示，同时大黄酸对照品及对照药材的色谱相应的位置上，也出现了相同的现象，结果见图1；氨熏后，大黄供试品薄层色谱中的斑点颜色由橙黄色转变为红色，结果见图2。在土大黄苷的检查薄层色谱中，大黄样品均无与土大黄苷对照品一样的亮蓝色荧光斑点，结果见图3。1212345678910R2R1图1不同产地大黄药材薄层鉴别色谱图（365nm）（R1：大黄对照药材；R2：大黄酸对照品；1～10：大黄供试品）图2不同产地大黄药材薄层鉴别色谱图（氨熏）（R1：大黄对照药材；R2：大黄酸对照品；1～10：大黄供试品）图3大黄土大黄苷色谱图（365nm）R：土大黄苷对照品；1～10：大黄供试品3.1.2水分检查对10批大黄药材样品进行水分测定，并对每批样品进行3个平行样测定，结果取平均值，求得其RSD（%）为0.00%～0.46%，均小于2.0%，符合偶然误差的限定。水分测定结果为6.02%～8.71%，平均值为7.00%，根据2020年版《中国药典》大黄所测水分不得超过15.0%，水分检查均合格，结果见表5。表5大黄水分测定结果（x±s,n=3）样品水分含量（%）RSD（%123456789由上表5结果可得，10批大黄药材中水分的含量较低，可能与超微粉碎后的干燥、灭菌工艺有关，该操作可使药材内部的水分明显减少。3.1.3总灰分检查对10批大黄药材样品进行总灰分检查，并对每批样品进行3个平行样测定，结果取平均值，求得其RSD（%）为0.16%～0.89%，均小于2.0%，符合偶然误差的限定。总灰分测定结果为3.37%～8.91%，平均值为3.37%，根据2020年版《中国药典》大黄所测总灰分不得超过10.0%，总灰分检查均合格，结果见表6。表6大黄总灰分测定结果（x±s,n=3）样品总灰分（%）RSD（%123456789由上表6结果可得，10批大黄药材中灰分的含量较低，可能与大黄经过净选、粉碎等工艺有关，这些操作极大程度上减少了药材自身的杂质。3.1.4二氧化硫残留量检查对10批大黄药材样品进行二氧化硫残留量检查，并对每批样品进行3个平行样测定，结果取平均值，求得其RSD（%）为0.26%～1.44%，均小于3.0%，符合偶然误差的限定。二氧化硫残留量测定结果为0~7.35mg/kg，平均值为2.10mg/kg，根据2020年版《中国药典》大黄所测二氧化硫残留量测定结果应≤150mg/kg，故大黄药材的二氧化硫残留量检查均合格，如表7所示。表7大黄二氧化硫残留量测定结果（x±s,n=3）样品二氧化硫残留量（%）RSD（%123456789注：“-”表示未检出。由上表7结果可得，10批大黄药材的二氧化硫残留量含量非常低，可能与大黄原药材基本不进行二氧化硫熏蒸加工有关。3.1.5浸出物检查对10批大黄药材样品进行水溶性浸出物检查，并对每批样品进行3个平行样测定，结果取平均值，求得其RSD（%）为0.06%～0.28%，均小于2.0%，符合偶然误差的限定。浸出物测定结果为33.53%～49.31%，平均值为42.11%，根据2020年版《中国药典》大黄所测浸出物不得少于25.0%，浸出物检查均合格，如表8所示。表8大黄浸出物测定结果（x±s,n=3）样品浸出物含量（%）RSD（%137.83±0.0523456789由上表8结果可得，10批大黄药材的浸出物含量普遍偏高，可能与超微粉碎之后的溶出增加有关。3.1.6含量测定对10批大黄药材样品进行总蒽醌与游离蒽醌的含量测定，对每批样品进行3个平行样测定，结果取平均值，求得总蒽醌含量其RSD（%）为0.00%～1.17%，游离蒽醌含量其RSD（%）为0.00%～3.77%，均不超过4.0%，符合偶然误差限定。总蒽醌含量测定结果为1.23%～2.13%，平均值为1.76%；游离蒽醌含量测定结果为0.32%～1.58%，平均值为0.94%，结果见表9。根据2020年版《中国药典》大黄中所测总蒽醌含量不得少于1.5%，游离蒽醌含量不得少于0.20%，10批大黄样品含量测定结果只有1批不符合药典规定总量，色谱图见图4。表9大黄中总蒽醌与游离蒽醌的含量（x±s,n=3）样品总蒽醌含量（%）RSD（%）游离蒽醌含量（%）RSD（%）10.53±0.0220.001.58±0.0130.631.18±0.0240.32±0.0150.70±0.0160.97±0.0171.43±0.0080.001.25±0.0090.000.86±0.00AABBCCA：芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸的混合对照品；B：大黄样品中的总蒽醌；C：大黄样品中的游离蒽醌；HPLC图由上表9结果可得，批号YPA7D0002的大黄样品总蒽醌及游离蒽醌含量最高；批号YPA7D0004的大黄样品总蒽醌及游离蒽醌含量最低，其中总蒽醌含量不符合2020年版《中国药典》大黄中所规定总蒽醌含量。图4的HPLC图中大黄样品色谱图在与混合对照品色谱图相同保留时间处具有相对应的峰，说明测定的成分为大黄药材中的总蒽醌及游离蒽醌。3.2各批次大黄综合评价结果3.2.1主成分分析采用IBMSPSS25软件，针对这10批大黄药材的质量检测结果，选择五个指标：水分检查、总灰分检查、浸出物检查、总蒽醌含量测定、游离蒽醌含量测定作为变量进行主成分分析，选择相关性矩阵，得到以上五个指标的分析结果见下表10、表11、表12、表13，主成分F1、F2的各项分析参数见下表14。表10KMO和巴特利特检验表KMO取样适切性量数巴特利特球形检验近似卡方自由度显著性

表11公因子方差表指标初始提取水分总灰分浸出物总蒽醌含量测定表12总方差解释表成分初始特征值总计方差百分比累积%提取载荷平方和总计方差百分比累积%13.38267.63267.6323.38267.63267.63221.23024.59492.2261.23024.59492.22630.2284.55796.78440.1282.55799.34150.0330.659100.00表13成分矩阵表因子载荷矩阵值提取成分数水分总灰分浸出物总蒽醌含量测定游离蒽醌含量测定表14主成分分析特征值、累积贡献率信息表主成分特征值方差贡献率（%）累积贡献率（%）F167.63267.632F224.59492.226由表10中得到的KMO取样适切性量数为0.645，可知这五个指标适宜用作因子分析的变量，且巴特利特球形检验计算所得显著性值(为0.000)<0.05，均说明本课题数据适合做主成分分析，选取的五个指标可为因子分析提供合理的分析基础。为了达到降维及信息浓缩的目的，综合本次分析结果，决定从5个指标中提取出2个特征值大于1的成分作为本次分析的主成分。这两个主成分的累计贡献率达67%以上，能很好地反应5个变量指标的情况。本次检查的10批大黄药材综合质量评价结果由其主成分对应的方差贡献率得出，记水分检查结果、总灰分检查结果、浸出物检查结果、总蒽醌含量测定结果及游离蒽醌含量测定结果标准化所得值分别为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5，主成分F1、F2因子载荷矩阵值分别为A、B，特征值分别为C1、C2，计算出主成分的变换矩阵U，主成分得分表达式见式（1）、式（2），再由变换矩阵U分别计算得出这10批不同产地大黄药材的主成分得分及综合得分，其表达式分别见式（3）、式（4）、式（5），计算出的10批大黄药材质量的主成分得分、综合得分及质量排名结果见下表15。Un=AnU’n=BnF1=U1×Z1+U2×Z2+U3×Z3+U4×Z4+U5×Z5（3）F2=U’1×Z1+U’2×Z2+U’3×Z3+U’4×Z4+U’5×Z5（4）F=0.67632×F1+0.92226×F2（5）表1510批大黄药材主成分得分、综合得分、排名信息表批号主成分得分F1主成分得分F2综合得分F综合排名YPA7D0001-0.89292.29361.51151YPA7D00022.4344-0.78300.92434YPA7D0003-0.8530-1.4408-1.90579YPA7D0004-3.6900-1.2652-3.662510YPA7D0005-0.21480.41680.23927YPA7D00061.2069-0.36550.47925YPA7D00071.9630-0.03071.29932YPA7D00081.6209-0.07531.02683YPA7D0009-0.51830.1658-0.19778YPA7D00010-1.05611.08420.28566根据主成分综合得分越高，质量越好的评价标准，并结合表15中批号为YPA7D0001的大黄药材综合得分F最高，可以初步推断，在这10批大黄药材中，批号为YPA7D0001的大黄药材质量最佳，侧面反映出该地区所产大黄的质量较优，其余大黄药材的主成分综合得分与批号为YPA7D0001的大黄药材综合得分相差较大，质量相对较次，其中，批号为YPA7D0003、YPA7D0004、YPA7D0009的大黄药材质量综合得分为负值，由此可初步推断出其质量较差。3.2.2系统聚类分析采用IBMSPSS25软件，对10批大黄药材进行系统聚类分析，以水分、总灰分、浸出物、总蒽醌含量测定、游离蒽醌含量测定为考察指标，将特征相似度高的大黄药材聚为一类，最终使特征差异较大的大黄药材进行分离，得到垂直冰柱图、树状谱系图见下图5、图6。图5系统聚类分析垂直冰柱图图6系统聚类分析树状谱系图在系统聚类分析的垂直冰柱图（图5）中，于聚类数目为3处作一水平线，以白色条形为间隔，将10个样本划分为3类；在树状谱系图（图6）中，以距离为10处作一垂直线，将10批样品分为了3类，与冰柱图分类相同。其中将批号5、8、6、7、2归为第一类，批号4为第二类，批号3、1、10、9归为第三大类。由表15可知，批号YPA7D0004的大黄药材主成分得分为负值，且由表9可知，该批次的大黄药材中总蒽醌及游离蒽醌含量不符合2020年版《中国药典》的规定，综合以上因素，故将其单独归为一类。其余批次根据5个考察指标结果的相似性，综合分析，将批号为YPA7D0001、YPA7D0003、YPA7D0009、YPA7D00010的大黄药材归为一类，其余批号的大黄药材归为另一类。

4结论在365纳米波长下，可以看到大黄供试品薄层色谱中，有荧光斑点显示，同时大黄酸对照品及对照药材的色谱相应的位置上，也出现了相同的现象，证明这10批药材均为大黄药材。水分测定结果为6.02%～8.71%，平均值7.00%，不超过药典规定15.0%，水分检查均合格。总灰分检查结果为3.37%～8.91%，平均值为5.39%，不超过药典规定10.0%，均符合要求。水溶性浸出物结果为33.53%～49.31%，平均值42.11%，不少于药典规定25.0%，均符合要求。二氧化硫残留量测定结果为0~7.35mg/kg，平均值为2.10mg/kg，不超过药典规定150mg/kg，二氧化硫残留量检查均合格；总蒽醌含量测定结果为1.23%~2.13%，平均值为1.76%，药典规定不得少于1.5%，部分批次不符合要求。游离蒽醌含量测定结果为0.32%~1.58%，平均值为0.94%，药典规定不得少于0.20%，所有批次均符合要求。本次实验的10批大黄药材可按照主成分分析、系统聚类分析分为3类，由表15可知，批号YPA7D0004的大黄药材主成分得分为负值，排名最后一名，且结合表9数据，该批次的大黄药材中总蒽醌及游离蒽醌含量不符合2020年版《中国药典》的规定，故将批号YPA7D0004的大黄药材单独归为一类。综合5个考察指标结果的相似性分析，因批号YPA7D0001、YPA7D0003、YPA7D0009、YPA7D00010的大黄药材在浸出物检查、总蒽醌及游离蒽醌含量测定结果均小于除YPA7D0004以外批次，故归为一类，其余批号的大黄药材归为另一类。综合本实验所有测定及检查结果，可以初步认为的批号为YPA7D0001的大黄药材质量最佳，其次为批号YPA7D0007的大黄药材，这为进一步分析影响大黄质量优劣的因素提供了方向。

5讨论本课题研究采用2020年版《中国药典》方法对大黄药材进行薄层鉴别、水分检查等考察。在本实验全过程均使用精密度较高的万分之一电子天平进行样品称量，确保使实验误差尽可能减小。同时，为了保证称样时准确度，在使用万分之一电子天平称量前需将电子天平进行校准，同时应待电子天平读数稳定10s后再进行读数并记录数据，确保读数精确。在薄层鉴别实验操作过程中，需确保点样量的取样合适，保证斑点的显示清晰、不拖尾。关于展开剂的制备，需注意展开剂各个组分的密度不同，易导致所制备的展开剂出现分层，因此已按比例混合的展开剂需超声充分，得到均一的展开剂。针对大黄原药材与对照药材的薄层鉴别实验，出于对所用展开剂极性的要求，此实验展开剂需进行充分混合，再用分液漏斗分取上层溶液进行薄层板展开。此外，载有样品的薄层板需经预饱和后再进行展板，以确保薄层板各位置的溶剂浓度一致，展开后所得色谱不出现边缘效应。为了保证药材所得数据的真实性及准确性，本实验的水分检查项目在取得样品后马上粉碎进行实验，以保证样品不在后续贮藏时，出现吸潮现象，导致结果出现误差。对于总灰分的检查，应保证大黄药材在炭化时不灰化，在充分炭化后再将样品转移至马弗炉里进行炽灼，同时需注意全程在风力稳定较小的环境下进行，避免灰分飞走，造成误差。水分检查及总灰分检查在恒重过程中应保证两次称量重量之差小于0.3mg。二氧化硫为有毒气体，为保证安全，二氧化硫残留量的测定选择在通风橱进行。进行滴定时，应准确滴定，在指示剂变色后30s内不褪