菊花种质资源离体保存技术规程

DB32/TXXXX—2019PAGE1菊花种质资源离体保存技术规程范围本标准规定了菊花种质资源离体保存的术语和定义、基本要求和常温生长离体保存、低温生长离体保存、超低温离体保存方法及再生与检测方法等。本标准适用于菊花种质资源的离体保存，菊属其他种质资源保存可参照执行。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1491花卉植物病毒检测规程术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1常温离体保存conservationatroomtemperatureinvitro在常温（25℃±2℃）下保存正常生长的离体保存物的方式。3.2低温离体保存conservationatlowtemperatureinvitro通过低温条件、改变培养基成分或添加抑制型植物生长调节物质等手段以延缓保存物生长速度的离体保存方式。3.3超低温离体保存cryopreservation在液氮（-196℃）中保存离体材料，使之代谢和生长基本停止，生物学状态相对稳定的离体保存方式。4材料要求4.1基本要求保存的材料应符合以下要求：a）用于保存的材料应该保证品种纯正，来源可靠，基本性状清楚，且未发生变异。b)依据DNY/T1491规定的方法进行病毒检测，确保材料不携带菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）等。4.2材料登记要求保存的材料应进行信息登记，内容包括种质名称或编号、产地或产权单位（人）、引种情况、保存情况等（见附录A）。5常温离体保存保存材料选择符合4.1条件的材料并按照4.2要求详细登记，利用生根培养30d左右、生长整齐一致的无菌苗为材料，切割成带2个～3个节的茎段供保存。保存容器采用规格为直径(18～30)mm×长(160～200)mm的试管，用内置硅胶圈的密封塑料盖或封口膜封口，贴好标注保存编号的标签。保存条件MS培养基均附加0.3mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH6.0。置于温度（25±2）℃、光照强度2000lx～3000lx、光照时间12h/d的条件下培养。每管加培养基15mL～25mL。保存数量每份种质5管以上，每管1个～2个茎段。继代时间视不同种质的生长速度，每2个～3个月继代1次。技术指标变异率≤2%；无菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）。6低温离体保存6.1保存材料同5.1。6.2保存容器同5.2。6.3保存条件根据种质特点，下列两种方法可以选用一种:减少培养基养分水平法：低温（5±2）℃下，1/4MS或1/2MS+0.3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，该方法适宜地被、盆栽型菊花种质资源。添加抑制型植物生长调节物质法：低温（5±2）℃下，MS+0.3mg/6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，培养基中添加20mg/L～80mg/LABA，或者15g/L～20g/L甘露醇；地被、盆栽型资源宜添加低剂量ABA或甘露醇，切花型资源宜采用较高剂量。保存数量同5.4。继代时间视不同种质的生长速度，每8个～12个月继代1次。6.6技术指标变异率≤2%；无菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）。7.超低温离体保存7.1保存材料选择符合4.1条件的材料并按照4.2要求详细登记，利用生根培养30d左右、生长整齐一致的无菌苗为材料，切成0.5cm～1cm，含2个以上腋芽，在MS培养基附加30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH6.0，温度（25±2）℃、光照强度2000lx～2500lx、光照时间16h/d，培养2w～3w。7.2保存容器采用规格为直径(15～20)mm×长(120～160)mm试管，用内置硅胶圈的密封塑料盖，贴好标注保存编号的标签。7.3分离茎尖在无菌条件下，通过解剖镜逐层剥去外层叶片,切取1mm～2mm大小的茎尖。7.4保存数量每份种质5管以上，每管8个～10个茎尖。7.5预培养茎尖分别接种到含0.4mol/L蔗糖浓度的MS培养基内，4℃暗培养3d。7.6装载将无菌棉纸放置在培养皿中，用装载溶液(附录B)湿润。将8个～10个菊花茎尖包在棉纸中，迅速浸入装载溶液中，室温（25±2）℃下暗处理30min，取出后用无菌滤纸吸去多余装载液。7.7脱水将包有茎尖的棉纸团转入玻璃化保护剂PVS2（附录B），冰浴条件下处理15min。7.8冷冻保存将脱水（玻璃化）处理后包有茎尖的棉纸团转移至装有预冷新鲜玻璃化试剂PVS2的冷冻管中,密封塑料盖并用封口膜封口，迅速投入液氮中保存。7.9技术指标冻后再生率≥20%，变异率≤1%；无菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）。8.再生与检测8.1超低温保存材料的再生8.1.1化冻在无菌条件下，快速将冷冻管从液氮转移至40℃水浴中，剧烈震荡120s。然后将包有茎尖的棉纸团从冷冻管取出，在经灭菌的干燥滤纸放置30s。8.1.2卸载将化冻后包有茎尖的棉纸团转移到卸载液（附录B），室温（25±2）℃下放置10min，中间5min时换一次卸载液。然后将棉纸团展开，茎尖在卸载液中悬浮5min。8.1.3再生用含蔗糖1.2mol/L的MS液体培养基洗涤20min,滤纸吸干后接种到含0.1mg/LBA和0.01mg/LNAA的MS固体或半固体培养基中,在（25±2）℃条件下暗培养或弱光培养1d～3d后转入正常光照培养条件下培养2-3周。8.2检测8.2.1病毒检测保存再生后代的病毒检测按照NY/T1491的方法进行。8.2.2变异率检测取定植2个月后植株心叶，CTAB法提取DNA，采用20.0µLPCR反应体系，包括10×Buffer2.0µL，5mmol/LMg2＋1.5µL，10mmol/LdNTPMixture0.8µL，5U/µlTaq酶0.2µL，20µmol/LISSR随机扩增引物0.5µL，ddH2O13.0µL，模板DNA2.0µL。所用的扩增反应程序为95℃预变性5min，94℃变性45s；53℃复性40s；72℃延伸70s，45个循环，72℃延伸7min，最后4℃保存。电泳结束后凝胶成像系统分析仪中观察并拍照，比较离体保存苗与对照苗的条带差异。附录A（资料性附录）菊花种质资源离体保存登记表表A.1菊花种质资源离体保存登记表种质名称或编号（中文）种质名称或编号（英文）其他名称原产地或引种单位产权单位（人）来源地或引种单位引种人引种时间引种数量采集号或引种号保存号保存方法保存时间保存数量保存者继代次数继代时间保存数量操作人附录B（资料性附录）菊花种质超低温离体保存溶液的配制B.1装载液MS培养基＋184ml/L甘油＋137g/L蔗糖，pH5.8，0.22µm滤膜过滤灭菌。B.2