绿色荧光蛋白GFP基因的克隆和表达

和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白;当受到紫外或蓝光激发时,GFP发射绿色荧光;它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的;GFP由3个外显子组成,长；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内;发色团是和氧化形成.GFP样结构,长420nm,宽240nm,由11个围折叠组成,荧光基团的形成桶的顶部由3个短的垂直片直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内;甚至测序;质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外,能够自主复制的稳定的遗会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到同的;有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制,因此每个细胞中只含一个或几个拷贝,称为严谨型质粒,有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严,称为松弛型制,以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千;方法转化进细菌时,转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型,例如,把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后,原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型;借助转化菌获得的新表型特征,可证实质粒已转入宿主细菌中,这样就可以作为转化菌的选择性标记;1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落,接种到含适当抗生素的液体培养基中养若干小时,以便对质粒进行选择性扩增;绕状态而不能彼此分开;当条件恢复正常时如加入酸性的NaAc或Kac中和碱性于上清中;凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA,尽管分子量相同,但具有不同的电泳迁移三、实验材料、仪器及试剂pEGFPNDHmLLB中;摇晃过夜;夜;培养箱,超净台,恒温摇床,制冰机,台式离心机,小型混合器,冰箱1.取DH5α培养液倒入eppendorf管中,13000rpm离心1min;3.弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽;悬浮于100μL溶液Ⅰ中需剧烈振荡,室温下放置10min;5.加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管5次,以混匀内容物千万不要振荡,6.加入150μL预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中15分rpm5min;7.上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的氯仿/异戊醇24：1,振荡混匀,13000rpm离心2min;8.将水相移入干净eppendorf管中,加入等体积的氯仿/异戊醇24：1振荡混匀,13000rpm离心2min;9.将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后,置于室温下2min,然后10.弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mL70％乙醇洗沉淀一次,振荡混匀rpmmin;11.吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥;12.将沉淀溶于30μLTE缓冲液,含20μg/mLRNaseA中,保存在-20℃冰箱中;质粒DNA浓度的测定学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度;实验材料与仪器pEGFP－N3和pET-28aDNA对照;4.按下sample,记录260nm下DNA的浓度mg/ml;并同时记录Dnmnm胶电泳琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法;分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比;分子越大,迁移的越慢,因为摩擦阻力越大,也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子;2琼DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关;3DNA的构象超螺旋环如10×buffer,电导率升高,使得应用适中的电压也会产生大量的热能,最严重时三、实验材料、仪器及试剂冰箱,蓝盾可见光透射仪成商业化酶的主要部分;大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上,因而3333DNA化在两条DNA链酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基OHDNA5’-末端具有一个磷酸基团-P;5335pEGFPNpETaDNA水浴锅、移液器、电泳槽、电泳仪、振荡器、制冰机、蓝盾可见光透射仪、BamHI10U/μLTaKaRa公司;NotI10U/μLTaKaRa公司,T4ligase作步骤μL混合：PNpETaBamHINotI2222BSA液334.适当放置冷却,45℃左右倒于电泳胶板上,插好梳子;5.待凝胶凝固好以后,拨下梳子;6.酶切样品中加入5μl溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀,上样;7.1×TBEBuffer,80V3-4V/cm下电泳30min;NA加入加样孔中3)跑胶,观察结果,并且拍照;4)用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来,称取重量;g00μL的体积加入PN;6)50℃水浴放置10min,期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解;7)将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中,吸附柱再放入收集管,13000rpm离心60s,弃掉废液;L漂洗液PW,13000rpm离心60s,弃掉废液;L漂洗液PW,13000rpm离心60s,弃掉废液;rpmmin;洗脱缓冲液先在65℃水浴预热,室温放置2min,13000rpm离心1min,然后将离心的溶液重新加;16℃连接过夜;512实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化转化大肠杆菌细胞的原理和方法;胞膜的透性发生改变,此时的细胞即呈现为感受态;这一方法可以用于批量制备感胞可在-70℃冻存;转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37℃培养1hr,可使质粒DNA中编码抗生素抗性的基因得以表达,因此,转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长,而没有转化的细胞则无法生长;实验材料、仪器2.使用仪器液器、超净工作台、离心机、振荡培养箱,制冰机管+1+2氨苄青管+1+22．感受态细胞的制备CaCl2法(1)挑一大肠杆菌单菌落放入3mlLB液体培养基含Kan+,37℃培养过夜;(2)活化大肠杆菌：取3ml新鲜的LB液体培养基加入50-150μl的过夜菌,培养2-3个小时;(3)将昨夜摇出来的DH5α或BL21培养液转入离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下4000rpm离心(4)弃去上清,用预冷的L的CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞,冰上放置20min,4℃下4000rpm离心(5)弃去上清,加入300μL预冷的L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置5min,即成感受态细胞悬存;l上放置30min;s,热激后迅速置于冰上冷却5min;LLB液体培养基,混匀后在37℃振荡培养30min;4从管1中取50μL涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,从管2中取50μL和100μL涂布于含抗生平板上;正面向上放置约10分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养20小时;+管重组质粒DNA是利用限制性内切酶如BamHI和NotI分别酶切基因片段和质粒再利用相同的限制性内切酶识别重组基因片段两侧的酶切位点,通过酶切下的重ANA酶,脱氧核苷三磷酸底物和靶序列即模板等五部分组成,缺一不可;PCR技术能在试管中建立反应,经数小时之后,就能将极微量的某一特定的目供了一种强有力的手段,对整个生命科学的研究与发展都有深远的影响;因此,PCR技术产生的时间虽不长,却以惊人的速度广泛地应用于分子生物学的各个领域;它可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面;三、实验材料、仪器及试剂PCR仪,掌中宝离心机,冰箱,小型混合器,电泳槽和电泳仪,离心管,移液器及吸箱1.双酶切法(1)随机挑取2个单菌落,接种,37℃振荡培养过夜;(2)质粒DNA的提取碱裂解法;(3)双酶切鉴定体系10μl;BamHIXhoI221166(4)室温酶切;(5)配制%M/V普通琼脂糖凝胶20ml;(6)酶切样品中加入5μl溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀,上样;(7)1×TBEBuffer,80V3-4V/cm下电泳30min;(8)荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况,并照像;并确定最终的阳性克隆2.菌落PCR法(1)挑取菌落随机挑取5个菌落;首先使用无菌枪头挑取菌落,在已准备好的含有卡那抗菌素,分好区的固为保菌种,然后将余下菌置于eppendorf管中作为PCR反应模板;(2)PCR反应体系20μl95℃反应物体积/5min予变性cles72℃左引物10min延伸(4)PCR产物的右引物检测PCR产物加入Taq酶5U/μL编号加入DNA琼脂MgCl225mM5μl溴酚蓝-GeneFinder混合液,分别按糖凝胶电泳的加样孔,使用1%琼脂糖电泳分离;10×Buffer2(5)用荧光激ddH2O发器看结果,确定阳性克隆的位置;GFP白的诱导表达IPTGGFP及基本操作步骤;IPTG异丙基硫代β-L半乳糖苷是一种常见的诱导基因表达的诱导剂,结构类似乳糖;结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制;LacI基因编码调节蛋白,可以四聚体的形式结合到操纵OBLTRNAT7启动子位点,从而启动GFP基因的表达;实验材料和仪器BLpET28a重组质粒DNA离心机,冰箱,小型混合器,移液器,恒温培养箱,手持式紫外灯,超净工作台;1.取阳性克隆质粒DNA转化BL21；2.在含有Kan＋的固体培养基上,37℃培养20h；℃振荡培养过夜；4.取4支无菌带盖试管,加入新鲜LB液体培养基含有Kan＋5ml,按1：20稀释比例加入过夜菌,37℃3小时;5.加入IPTG1：1000至终浓度1mmol/L,分别诱导0h,1h,2h,4h;6.分别取,10000rpm离心5min,去除上清,收集沉淀,再重复一次收集沉淀;7.分别取IPTG诱导培养液20μl涂布在含Kan＋的固体培养基上,37℃培养20小时;8.观察蛋白表达用紫外线照射菌体沉淀及培养平板,可以看到绿色荧光;分别对均匀涂布的平板以及表达蛋白的样品管照相,保存照片;(1)学习从兔肝中提取RNA的原理和方法;(2)通过紫外吸收法测定RNA的含量;(3)利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性;从水相中沉淀,达到分离;胍或有机溶剂苯酚/氯仿等来解决;异硫氰酸根和胍离子都是很强的蛋白质变性剂,洁,尽量减少空气流动,如条件允许,可在超净工作台上进行;五、实验中RNA酶最有关的操作时,都应戴一次性手套,接触不干净的玻璃器皿和物品以后,手套就可验材料、仪器及试剂gmin内速冷冻保存于液氮或-70℃冰箱待用;mlLDEPC有①2mol/L乙酸钠,②100g/LSLSmolLSodiumCitrate柠檬酸钠,④CSB液42mmol/Lml解,加入8-羟基喹啉至终浓度为1g/L溶解混匀,此时溶液mmolL的乙酸钠抽提,重复数次,直至上层水相pH大于;作步骤①取0.2g组织,置入预冷的组织匀浆器中,在冰浴中匀浆,充分研碎组织;②加入变性液D,冰上匀浆至液体粘稠,无小组织块;lsec放置in⑧4℃离心,取上层水相,加等体积预冷异丙醇,-20℃放置20min~30min;⑩用20μlDEPC处理过的水溶解沉淀,取少量鉴定;RNA量的鉴定RNA用紫外分光光度计分别测波长230nm、260nm、280nmODRNAgLOD计算ODODOD0/OD280的比值以估测RNA的纯度;RNA完整性的鉴定1)配制%M/V普通琼脂糖凝胶;2)适当放置冷却,45℃左右倒于电泳胶板上,插好梳子;3)待凝胶凝固好以后,拨下梳子;4)取10μlRNA样品,3μl的genefinder染色,混匀,上样;5)1×TBEBuffer,60V3-4V/cm下电泳30min;6)紫外灯下观察RNA条带的分离情况,并照像;2)实验操作时应带手套,实验的仪器