常用分子生物学技术的原理及其应用-课件

常用分子生物学技术的原理及应用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第21章1ppt课件常用分子生物学技术的原理及应用第21章1ppt课件1第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridizationandBlottingTechnique2ppt课件第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridiz2精品资料精品资料3你怎么称呼老师？如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘……”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”常用分子生物学技术的原理及其应用--ppt课件4核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理5ppt课件核酸分子杂交(nucleicacidhybridiza5复性RNADNA6ppt课件复性RNADNA6ppt课件6（一）印迹技术印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子

转移(印迹)于固定化介质上并加以检测分析的技术。利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。7ppt课件（一）印迹技术印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中7用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”（probe)，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。探针种类：DNA（单链、双链），RNA探针标记：放射性同位素标记，生物素、地高辛、荧光素等。（二）探针技术8ppt课件用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多8二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹

(SouthernBlotting)Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

1975年,Southern印迹杂交（Southernblot）由英国人EdwinMellorSouthern创建。用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。

9ppt课件二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹(Southern9（二）RNA印迹(NorthernBlotting)

利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。

1979年，J.C.Alwine等提出，因其方法同Southern杂交十分相似，故称之为Northern杂交。

10ppt课件（二）RNA印迹(NorthernBlotting)

10（三）蛋白质的印迹(WesternBlotting)即Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

11ppt课件（三）蛋白质的印迹(WesternBlotting)11其他：斑点印迹(dotblotting)是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。

原位杂交(insituhybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交

DNA芯片技术(DNAchip)实际上就是一种大规模集成的固相杂交，是指在固相支持物上原位合成(insitusynthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。12ppt课件其他：12ppt课件12

Southern杂交的主要步骤

待测DNA样品的制备、酶切酶切片段的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性

Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备

Southern杂交杂交结果的检测13ppt课件Southern杂交的主要步骤13ppt课13三种印迹技术的比较14ppt课件三种印迹技术的比较14ppt课件1415ppt课件15ppt课件15放射自显影照片16ppt课件放射自显影照片16ppt课件16第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction17ppt课件第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReac17

多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。18ppt课件多聚酶链式反应KaryB.Mull185

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA一、PCR技术的工作原理5

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19ppt课件5Primer15Primer2Cycle2Cyc19Cycle35

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25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。20ppt课件Cycle3555555555520PCR反应体系与反应条件

PCR的反应体系：

10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul21ppt课件PCR反应体系与反应条件21ppt课件21PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C22ppt课件PCR的基本反应步骤变性延伸退火22ppt课件22PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸23ppt课件PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸23p23PCR产物以指数形式增加，即Y=2n

(n为循环次数)24ppt课件PCR产物以指数形式增加，即Y=2n24ppt课件24PCR扩增有限性-平台期及平台效应（plateaueffect）PCR扩增的平台效应25ppt课件PCR扩增有限性-平台期及平台PCR扩增的平台效应25ppt25PCR技术的特点1.高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍26ppt课件PCR技术的特点1.高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个262.高度的特异性引物引物

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。27ppt课件2.高度的特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异27引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。28ppt课件引物设计：28ppt课件283.操作简便易行

利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广

29ppt课件3.操作简便易行利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增29

既可是DNA，也可是RNA；既可是纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织，也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、培养细胞、血细胞），又可是体液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。4.适用样品的广泛性30ppt课件既可是DNA，也可是RNA；既可是纯化的，又30利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆31ppt课件利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因31利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突变32ppt课件利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、32将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析33ppt课件将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了33逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术34ppt课件逆转录PCR(reversetranscriptionP34原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。（二）原位PCR技术35ppt课件原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上35（三）实时PCR技术实时PCR(real-timePCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。36ppt课件（三）实时PCR技术实时PCR(real-timePCR)36实时PCR技术原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物荧光标记引物RQ3'3'5'5'37ppt课件实时PCR技术原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物荧光标37第三节核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis38ppt课件第三节核酸序列分析38ppt课件38核酸序列分析的基本原理：化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(Sanger法)39ppt课件核酸序列分析的基本原理：化学裂解法(Maxam-Gillb39一、DNA链末端合成终止法40ppt课件一、DNA链末端合成终止法40ppt课件40GATC

测序反应

电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

正极负极ddGddAddTddC链末端合成终止法测定DNA序列的原理41ppt课件GATC测序反应电泳5'3'正极负极ddGddA41二、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。42ppt课件二、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列42ddGddAddTddC红色荧光绿色荧光黄色荧光蓝色荧光电泳DNA序列自动分析原理及结果图43ppt课件ddGddAddTddC红色荧光绿色荧光黄色荧光蓝色荧光电泳43第四节基因文库GeneLibrary44ppt课件第四节基因文库44ppt课件44基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。45ppt课件基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)45一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有

噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。46ppt课件一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的46建立基因组文库的一般程序1．载体DNA片段的制备

DNA分离纯化

限制酶切脱磷酸化反应2．供体DNA片段的制备总DNA分离纯化机械剪切法分离特定大小DNA片段酶法部分酶切分离特定大小DNA片段（完全酶切）

47ppt课件建立基因组文库的一般程序1．载体DNA片段的制备47ppt课473.供体与载体DNA连接要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。4.重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）。48ppt课件3.供体与载体DNA连接48ppt课件48基因组文库和cDNA文库的构建和筛选49ppt课件基因组文库和cDNA文库的构建和筛选49ppt课件49cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、cDNA文库50ppt课件cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRN50cDNA文库的特点1.基因特异性

常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA。2.器官特异性

不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。51ppt课件cDNA文库的特点1.基因特异性51ppt课件513.代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同

4.不均匀性在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。

5.各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）

52ppt课件3.代谢或发育特异性52ppt课件52第五节生物芯片技术BiologicalChipTechnique53ppt课件第五节生物芯片技术53ppt课件53是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物（多聚赖氨酸硅胶）上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)54ppt课件是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支54

基因芯片的工作原理：与经典的核酸分子杂交方法（southern

、northern）是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。

基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。

55ppt课件基因芯片的工作原理：与经典的核酸分子杂交方法（so55基因芯片工作流程示意图56ppt课件基因芯片工作流程示意图56ppt课件56是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质芯片(proteinchip)蛋白质芯片作用原理57ppt课件是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当57第六节生物大分子相互作用研究技术

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy58ppt课件第六节生物大分子相互作用研究技术58ppt课件58一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选常用蛋白质相互作用的研究技术59ppt课件一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交常用蛋白质相互作用的研究59标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。60ppt课件标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外60标签融合蛋白沉淀实验流程示意图61ppt课件标签融合蛋白沉淀实验流程示意图61ppt课件61（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途62ppt课件（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途62ppt课件62酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。63ppt课件酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用63电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gelshiftassay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定64ppt课件电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobi64放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10X凝胶迁移实验结果示意图65ppt课件放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X65染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法66ppt课件染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprec66染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图67ppt课件染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图67ppt课件6768ppt课件68ppt课件68遗传修饰动物模型的建立及应用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第七节69ppt课件遗传修饰动物模型的建立及应用TheEstablishmen69转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。

转基因——被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——目的基因的受体动物一、转基因技术70ppt课件转基因技术转基因——被导入的目的基因一、转基因技术70ppt7071ppt课件71ppt课件71核转移技术

即动物整体克隆技术，将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。二、核转移技术72ppt课件核转移技术二、核转移技术72ppt课件72基因剔除技术(geneknockout)

也称基因靶向(genetargeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术73ppt课件基因剔除技术(geneknockout)三、基因剔除技73将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。操作方式74ppt课件将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonicstemc74建立动物模型①单基因决定疾病模型基因剔除获得性突变(gain-of-functionmutation)②多基因决定疾病模型四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用75ppt课件建立动物模型四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用75pp75基本步骤a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为置换型载体。b．ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。

76ppt课件基本步骤a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异7677ppt课件77ppt课件77ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。

78ppt课件ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)78ｅ．表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

f．得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。79ppt课件ｅ．表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目7980ppt课件80ppt课件80第八节疾病相关基因的克隆与鉴定CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes81ppt课件第八节疾病相关基因的克隆与鉴定CloningandIde81功能克隆(functionalcloning)定位克隆(positionalcloning)克隆疾病相关基因的策略82ppt课件功能克隆(functionalcloning)克隆疾病相关82定义

从对一种致病基因的功能的了解出发来克隆该致病基因。（一）功能克隆应用