荧光定量核酸检测技术

关于荧光定量核酸检测技术主要表现为PCR产物分析手段落后：

琼脂糖凝胶电泳法只能判断产物片段大小，并不能鉴别产物特异性。造成传统PCR检测缺点非特异性难以判断、假阳性多和重复性差等。实验室管理制度落后；人员培训水平落后；国内PCR市场存在的问题第2页,共36页，2024年2月25日，星期天反相膜杂交技术

复星微孔板杂交技术

复星、华美、复华、浩源、锦宏荧光PCR技术

复星、达安、匹基国内发展的核酸检测新技术第3页,共36页，2024年2月25日，星期天反相膜杂交技术原理首先将特异性探针交联在固相载体膜上，这时载体膜以及膜上的探针相当于固定相，当膜条的一端与带有杂交反应物的液面接触时，带有生物素标记的基因片段、标记酶、酶底物依次通过这个固定点时，其表现的效应行为类似于过滤或者是亲和层析，这时探针有机会与流动相中的靶序列充分作用特异性结合（杂交），再经过酶显色最终显示出蓝紫色斑点。第4页,共36页，2024年2月25日，星期天反相膜杂交原理示意图第5页,共36页，2024年2月25日，星期天主要优点：1.操作简便；2.无特殊设备要求；

3.适合于分型；4.结果可原始保存。主要缺点：只能进行半定量操作第6页,共36页，2024年2月25日，星期天微孔板杂交技术原理具体来讲，用生物素（Biotin）标记的PCR扩增产物，与固定在酶标板上的链霉亲合素（Streptavidin，SA）结合，再与抗原标记的特异性HBV探针进行正向法杂交。产物通过探针连接的抗体酶识别基团和标记碱性磷酸酶的抗体特异结合后，酶催化底物，在酶标板中显出颜色，通过酶标仪读取光吸收值。第7页,共36页，2024年2月25日，星期天微孔板杂交技术原理示意图第8页,共36页，2024年2月25日，星期天主要优点：

1.杂交部分操作类似于ELISA，实验人员较熟悉；

2.可向全自动过度；

3.可定量操作。主要缺点：

1.分型困难；

2.试剂成本较高；

3.操作较复杂。第9页,共36页，2024年2月25日，星期天荧光PCR技术原理荧光PCR试剂比常规PCR试剂多一个寡聚核苷酸探针，这个探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子，完整的探针在激发光激发下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，样品无荧光。而PCR过程中。Taq酶分子在链延长过程中可以通过自身的5’3’核酸外切酶降解与模板结合的特异性荧光探针，使得荧光发光分子从探针上切下来而与荧光淬灭分子分开，从而在激发光激发下产生特定波长的荧光，这种荧光随着PCR扩增过程而动态增强。第10页,共36页，2024年2月25日，星期天荧光PCR技术原理示意图第11页,共36页，2024年2月25日，星期天主要优点：

1.能对靶基因进行定量检测；

2.在封闭状态下进行产物检测，减少了污染机会。主要缺点：

1.仪器设备昂贵，不利于推广；

2.分型困难。第12页,共36页，2024年2月25日，星期天核酸检测实验室的设置为了防止由标本（微生物或非微生物）和靶核酸模板以及经PCR扩增的靶核酸片段所引起的交叉污染，核酸检测实验室中应设置三个专用的实验室。前PCR区1（试剂配制实验室）

用途：该实验室是无临床标本和无核酸污染区，用于配制各类试剂及设置PCR扩增反应管无（靶核酸模板）。

基本设备：1.实验应有紫外灯；2.PCR防污染罩；

3.冰箱（4℃，-20℃）；4.台式小型高速离心机、旋涡振荡器、各种规格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；5.高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸嘴；6.专用文具用品；7.实验桌椅（实验台台面防酸、防碱和耐热）；8.自来水设备第13页,共36页，2024年2月25日，星期天前PCR区2（标本制备实验室）用途：该实验室用于分离和抽提病原微生物中的核酸，防止因标本处理而引起的实验室感染和检测的交叉污染。基本设备：1.实验室应有紫外灯；2.超净台或PCR防污染罩；3.冰箱（4℃，-20℃）；4.高压灭菌器(处理传染性标本和物品)；5.高速和低速离心机、旋涡振荡器、各种规格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；6.高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸嘴；7.专用文具用品；8.救护药箱，包括外伤用药，眼睛冲洗液等；9.实验桌椅（实验台台面防酸、防碱和耐热）；10.电话机（备有关临床医生的电话号码，以便因突发事件及时联系）；11.自来水设备。第14页,共36页，2024年2月25日，星期天后PCR区（扩增和分析实验室）用途:该实验室用进行PCR扩增和PCR扩增产物的各类分析操作。

基本设备：1.实验室应设有紫外灯；2.各类PCR扩增仪；3.电泳仪、电泳槽、紫外分析仪；4.照相设备或凝胶分析系统；5.台式小型高速离心机、孵育箱（水浴或恒温）；6.冰箱（4℃、-20℃）；7.微波炉；8. 配套移液器（若干）；9.高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸嘴。10. 电脑和专用文具用品、救护药箱；11.实验桌椅（实验台台面防酸、防碱和耐热）；12. 自来水设备;13.其他仪器：根据检测方法不同而定。第15页,共36页，2024年2月25日，星期天定量技术比较第16页,共36页，2024年2月25日，星期天第17页,共36页，2024年2月25日，星期天试剂盒的检测灵敏度第18页,共36页，2024年2月25日，星期天荧光定量PCR试剂盒检测HBV-DNA结果

与临床的关系第19页,共36页，2024年2月25日，星期天经统计，X2=1.15，P<0.05，表明在HBsAg/HBeAg/抗HBc阳性和HBsAg/抗HBe/抗HBc阳性组中病毒载量的差异显著，HBVDNA和HBeAg密切相关。该定量结果能够反映在这两种血清学模式中病毒DNA的复制情况，对于临床辅助诊断有重要作用。表.在HBsAg/HBeAg/抗HBc阳性和HBsAg/抗HBe/抗HBc阳性组中病毒载量频数分布

第20页,共36页，2024年2月25日，星期天慢性肝炎患者干扰能治疗过程中病毒核酸

的动态变化

上海第二医科大学附属瑞金医院传染科（200025）

罗振辉厉惠莉高健张东华摘要：本文采用探针杂交定量检测HBV-DNA，动态检测了15例慢性乙肝患者干扰能治疗前、后和治疗过程中的HBV-DNA的变化，除见干扰能抑制病毒复制的作用外，且HBV-DNA的变化较eAg阴转和ALT下降更敏感、更确切的反映了干扰能的疗效。干扰能疗效的个体差异甚大，似和机体感染的严重程度及自身的清除能力有关，HBV-DNA的动态检测，结合eAg和ALT的变化，可有助于决定适当的剂量和合理的疗程。第21页,共36页，2024年2月25日，星期天

部分讨论：15例病人中eAg均为阳性，但HBV-DNA值的差异甚大，从1.768Meq/ml到4800Meq/ml，该值更确切的反映了机体的感染状态，其高低可能与感染的严重程度及病毒复制的活跃情况呈正相关；与机体免疫清除的时间和强度呈负相关。高值示感染严重或清除无力；反之表示感染较轻或清除强力。实验表明HBV-DNA低值者疗效较佳；无论HBV-DNA值是高是低，治疗后HBV-DNA均见一定程度下降，其下降的幅度与病例的选择；eAg的阴转率6个月时为8/15，和国内外诸多报告大致相似，此变化和HBV-DNA值的低下基本吻合，但HBV-DNA值在6个月时已有9例小于0.7Meq/ml，且见HBV-DNA的变化大多早于eAg的阴转，一般提早2个月，个别提前4个月，可见HBV-DNA值的检测远较观察eAg更敏感、更确切的反映了干扰能抗病毒的作用。第22页,共36页，2024年2月25日，星期天ALT的变化通常也是评估干扰能治疗的重要指标，本组病例6个月时ALT下降至正常者为11/15（73.3%），无明显变化或升高者为4/15，此变化和HBeAg的阴转大致吻合，但和HBV-DNA低下并非完全一致。2号病例持续用药至8个月时ALT明显升高，继续减量用药后，HBV-DNA低下，有力的说明了ALT升高是机体清除病毒的正常表现，故以ALT复常为评估指标应有辨证的观点。结论：HBV-DNA值的变化充分反映了干扰能抑制病毒复制的作用明显，且HBV-DNA的变化较eAg阴转和ALT下降更敏感、更确切的反映了干扰能的疗效。对于每一病例应具体分析，力争以HBV-DNA值作为观察疗效的指标，决定适当的剂量，反复或更长的疗程，也许是未来抗病毒治疗的方向。第23页,共36页，2024年2月25日，星期天对HBV抗病毒治疗的定量检测建议针对拉米夫定治疗乙型肝炎的定量检测建议针对干扰素治疗乙型肝炎的定量检测建议可以研究联合用药，并用定量检测来评估疗效第24页,共36页，2024年2月25日，星期天针对拉米夫定治疗乙型肝炎的定量检测建议

根据《拉米夫定临床应用指导意见》（由“拉米夫定临床应用专家指导小组”制定），我们提出了以下对乙型肝炎病人的定量检测建议：病人的选择：HBVDNA定量检测；观察项目及随访：血清病毒学标志：HBeAg，抗HBe，HBVDNA，治疗目标和疗效判断：病毒学标志改善：HBV-DNA阴转（斑点杂交或定量法降低>2log10）;停药标准：达显效病人，继续用药3-6个月，仍为显效者，可停药；停药后，继续随访观察6-12个月，每3-6个月复查HBVDNA。第25页,共36页，2024年2月25日，星期天丙型肝炎病毒的核酸检测丙肝：输血后肝炎主要原因急性期2－26周（平均7.4周） 潜伏期1－2个月酶免检出率：1月17.4％

2－6月60－80％

1年80％病毒特点：滴度低；免疫反应弱；变异快第26页,共36页，2024年2月25日，星期天HCV病毒载量监测实验在常规病人护理中扮演的角色开始治疗改变治疗方案选择治疗方案确证疗效第27页,共36页，2024年2月25日，星期天通过监测HCV病毒滴度反映疗效WeeksMedianHCVRNA(copies/ml)第28页,共36页，2024年2月25日，星期天IFN-

单次给药后HCV-1病毒滴度变

化的定量监测N=32genomes/ml*1million第29页,共36页，2024年2月25日，星期天淋病双球菌（NG）的核酸检测标本取材：男性：作尿道挤压和前列腺按摩以取得尿道口分泌物女性：宫颈口分泌物诊断方法：

1、涂片染色：在中性粒细胞中寻找革兰氏阴性的双球菌简便易行，但灵敏度不高，女性病人检出率仅50%左右

2、分离培养：WHO推荐

培养较困难，生化鉴定复杂，时间长

3、ELISA检测抗原存在交叉反应第30页,共36页，2024年2月25日，星期天由于PCR具有敏感性高、特异性强等优点，适用于淋病的快速诊断和流行病学调查。利用PCR可以帮助解决的主要问题有：（1）对分离培养的菌株进行鉴定和进一步分析。（2）提高检测临床标本的阳性率和准确性。（3）用于抗生素治疗的疗效观察。（4）对淋球菌菌株进行分子流行病学分析。第31页,共36页，2024年2月25日，星期天沙眼衣原体（CT）的核酸检测标本取材：同淋球菌在非淋性尿道炎中，由衣原体引起的占50%以上，健康人群约有10%感染率。诊断方法：（1）细胞培养繁琐、费时，且培养条件不适、标本运送不当、标本不足等因素均可影响检测敏感度。（2）免疫荧光法、酶联免疫法简便快速，但灵敏度和特异性均低于培养法。第32页,共36页，2024年2月25日，星期天应用PCR检测方法灵敏度、特异性可达94~100%，可做为临床上各种