酶免检测技术影响

关于酶免检测技术影响酶免技术的分类实验注意事项实验中常见问题及解决方法第2页,共24页，2024年2月25日，星期天

均相法双抗原夹心法（测抗体）直接法双抗体夹心法（测抗原）

酶免法间接法测抗体、抗原EIA非均相法

ELISA竞相法测抗体、抗原

捕获法测IgM抗体enzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定法

酶免技术的分类第3页,共24页，2024年2月25日，星期天双抗体夹心法

HBsAg、HBeAg双抗原夹心法

HBsAb夹心法第4页,共24页，2024年2月25日，星期天HBcAb、HBeAb竞争法第5页,共24页，2024年2月25日，星期天HDVIgG/M、HEVIgG/M

测IgG测IgM间接法第6页,共24页，2024年2月25日，星期天HAV-IgM捕获法测IgM第7页,共24页，2024年2月25日，星期天第8页,共24页，2024年2月25日，星期天实验注意事项1、标本避免溶血尽量新鲜，避免细菌污染

一般5天内检测的血清可4℃保存，否则低温保存。

第9页,共24页，2024年2月25日，星期天2、试剂使用前平衡至室温配置洗液应使用去离子水或蒸馏水，保证水的新鲜3、设计实验设计好孔位，通常阴阳对照孔各2孔、空白1孔。必要时做好标注，避免错误第10页,共24页，2024年2月25日，星期天4、加样样品应全部加于反应孔底部，避免液体悬挂在孔壁上。加样量准确！加下一标本时更换吸嘴第11页,共24页，2024年2月25日，星期天5、加酶结合物一般使用滴瓶滴加滴加时应保持瓶身垂直、加液速度适中，使液滴大小均匀一致一步法时先加样本后加酶，不可颠倒顺序一般空白孔只加底物和终止液，而不能加入其它物质，尤其是酶结合物第12页,共24页，2024年2月25日，星期天6、温育温度、时间要严格控制！最好使反应杯尽快升温到所需温度最好放入湿盒或水浴箱中反应板贴上即时贴

微孔板放入水浴箱后，孔内温度上升到37℃需要一定时间。但实际工作中很少有人注意这个问题，通常是放入即计时，导致实际温育时间不够，弱阳性标本漏检。解决：微孔板放水面上或湿盒中纱布浸透水，使板底部直接与37℃接触，迅速达到温度。第13页,共24页，2024年2月25日，星期天7、洗板使用专用洗涤液一般洗涤4~6次若手工洗涤，前两次洗涤应不溢出反应孔污染后面几次洗涤应加满所有孔干净每次加洗涤液后应浸泡30秒再甩去洗液反应板倒扣吸水纸上拍干洗板时应注意非离子去垢剂的浓度。洗液中Tween20高于0.2%,可使包被子固相上的抗体抗原解吸附而影响测定下限。第14页,共24页，2024年2月25日，星期天8、加底物底物A液通常是H2O2还原剂底物B液通常是TMB（3、3′、5、5′-四甲基联苯胺）氧化剂TMB氧化后呈蓝色，被2NH2SO4终止后呈黄色，450nm波长处有最大吸收峰底物B应避光保存，实验时加完底物A、B保温时也应避光保存。第15页,共24页，2024年2月25日，星期天9、比色空白孔校零，读取各孔OD值单波长or双波长的选择：

单波长通常是对显色具有最大吸收的450nm或492nm

双波长酶标仪则在敏感波长450nm和非敏感波长630nm下各测定一次。使用双波长时不必设定空白孔，否则会造成孔吸光度数为负数。若底物为OPD（邻苯二胺），波长为492nm

若底物为TMB，波长为450nm第16页,共24页，2024年2月25日，星期天10、结果判读不同试剂，CUTOFF值计算方法不同第17页,共24页，2024年2月25日，星期天常见问题及解决办法内源性标本因素：1、类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgGFc段非特异结合，因此可能与包被的IgG以及随后加入的酶标IgG结合而产生假阳性。2、补体：包被抗体及随后加入的酶标抗体均能激活补体而与补体C1q位点结合而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低3、异嗜性抗体：人血清中含有抗齿类动物（羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。4、溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。外源性标本因素：1、溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温育时吸附固相可与HRP显色。2、细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或直接影响酶标抗体作用，并且细菌引起标本混浊。3、标本4℃存放过久：IgG聚合成二聚体，间接法中易假阳性。建议<1周4、标本凝固不全：残留纤维蛋白原形成的纤维蛋白块，造成假阳性。第18页,共24页，2024年2月25日，星期天第19页,共24页，2024年2月25日，星期天第20页,共24页，2024年2月25日，星期天第21页,共24页，2024年2月25日，星期天设备管理人员第22页,共24页，2024年2月25日，星期天你愿意…

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