荧光定量原理与应用第二版

关于荧光定量原理与应用第二版提纲PCR简介

荧光定量PCR技术原理荧光化学物质简介定量方法实时荧光定量PCR技术简介：第2页,共50页，2024年2月25日，星期天PCR概念什么是PCR？PolymeraseChainReaction(PCR)聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定DNA片段的方法。第3页,共50页，2024年2月25日，星期天ClassicPCR第4页,共50页，2024年2月25日，星期天ClassicPCR第5页,共50页，2024年2月25日，星期天PCR循环第一步加热变性、双链打开第二步退火、引物与单链结合第三步-引物延伸变为两个双链DNA第6页,共50页，2024年2月25日，星期天第7页,共50页，2024年2月25日，星期天常规PCR常规PCR技术：PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析S1S2MDNAEngine第8页,共50页，2024年2月25日，星期天提纲PCR简介

荧光定量PCR技术原理荧光化学物质简介定量方法实时荧光定量PCR技术简介：第9页,共50页，2024年2月25日，星期天定量PCR定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析IQ5Real-timePCR仪第10页,共50页，2024年2月25日，星期天PCR反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶引物模板DNA或缓冲液荧光物质第11页,共50页，2024年2月25日，星期天提纲PCR简介荧光定量PCR技术原理

荧光化学物质简介定量方法实时荧光定量PCR技术简介：第12页,共50页，2024年2月25日，星期天

SYBRGreen1

TaqMan荧光化学第13页,共50页，2024年2月25日，星期天SYBRGreenISYBRGreen1第14页,共50页，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI工作原理

SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位

SYBRGreen1染料结合状态时荧光强度是非结合状态的800-1000倍GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第15页,共50页，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI第16页,共50页，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI第17页,共50页，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI第18页,共50页，2024年2月25日，星期天与传统PCR的比较实现了初始模板的绝对定量检测灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因可以区分微小的拷贝数差异可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量省时省力检测设计灵活第19页,共50页，2024年2月25日，星期天MeltCurveAnalysis第20页,共50页，2024年2月25日，星期天MeltCurveAnalysis第21页,共50页，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI优点

使用方便 ---不必设计复杂的荧光探针

没有序列特异性---可以用于不同的模板

便宜

灵敏第22页,共50页，2024年2月25日，星期天SYBRGreenI缺点

与非特异性产物结合第23页,共50页，2024年2月25日，星期天TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针第24页,共50页，2024年2月25日，星期天TaqMan

目标特异性探针

5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补第25页,共50页，2024年2月25日，星期天TAQMANProbes第26页,共50页，2024年2月25日，星期天TAQMANProbes第27页,共50页，2024年2月25日，星期天TAQMANProbes第28页,共50页，2024年2月25日，星期天TAQMANProbes第29页,共50页，2024年2月25日，星期天TaqMan优点对目标序列有很高的特异性

---特别适合于SNP检测第30页,共50页，2024年2月25日，星期天TaqMan缺点

价格较高

只适合于一个特定的目标

不能进行融解曲线分析背景高第31页,共50页，2024年2月25日，星期天兼容化学试剂总结结合于双链DNA的小沟中发夹型杂交探针水解型杂交探针（5‘-3’外切）延伸复性任何步骤定量和检测目标基因融解曲线分析SNP分析定量和检测目标基因SNP分析定量和检测目标基因信号检测工作原理有否淬灭剂化学试剂否有有主要应用范围第32页,共50页，2024年2月25日，星期天荧光曲线

随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图第33页,共50页，2024年2月25日，星期天定量原理

如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析引入两个概念：荧光阈值、Ct值第34页,共50页，2024年2月25日，星期天定量原理荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)阈值线第35页,共50页，2024年2月25日，星期天Ct值的概念定量原理Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t)值C(t)值18.12+/0.04-阈值线第36页,共50页，2024年2月25日，星期天提纲PCR简介荧光定量PCR技术原理荧光化学物质简介定量方法实时荧光定量PCR技术简介：第37页,共50页，2024年2月25日，星期天

绝对定量确定初始模板的准确含量需要标准曲线

相对定量确定样品间初始模板的含量倍数差异相对标准曲线不使用标准曲线，利用Ct值计算

ΔCt方法

ΔΔCt方法（看家基因）

Pfaffl方法（考虑扩增效率）

Vandesompele方法（多看家基因）14500copies定量方法

第38页,共50页，2024年2月25日，星期天借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量得到未知样品初始量绝对值unknown104103Unknowncontains3108copies绝对定量第39页,共50页，2024年2月25日，星期天

ΔCT法相对定量无均一化处理均一化依赖于加样的一致性相对定量——ΔCT

Sample1Ct1(25)Sample2Ct2(22)ΔCT=Ct1-Ct2=25-22=3基因表达量Sample1/Sample2=2

–ΔCT=2-3=1/8第40页,共50页，2024年2月25日，星期天相对定量——ΔΔCTΔΔCT法相对定量考虑到了加样误差通常使用看家基因来完成均一化处理Sample1Ct1(25)Sample2Ct2(22)内参基因actinCt0120Ct0221ΔCT1=Ct1-Ct01=25-20=5ΔCT2=Ct2-Ct02=22-21=1ΔΔCT=ΔCT1-ΔCT2=5-1=4基因表达量Sample1/sample2=2-

ΔΔCT=2-4=1/16第41页,共50页，2024年2月25日，星期天SimpleComplex2

CT

假定目的基因与看家基因的扩增效率都是100%

只有一个看家基因

PfafflModification

考虑到扩增效率的影响只有一个看家基因

VandesompeleMethod

考虑到扩增效率的影响有多个看家基因相对定量第42页,共50页，2024年2月25日，星期天

利用相对标准曲线定量，定量结果相除得到倍数差别同时建立两条标准曲线一条目的基因的标准曲线至少再做一条看家基因的标准曲线借助标准曲线校准扩增效率的影响

使用标准曲线法进行相对定量分析相对定量——标准曲线法第43页,共50页，2024年2月25日，星期天

进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计用于优化扩增产物产量和特异性的参数

引物设计扩增片段选择试剂的浓度循环条件变性温度和退火温度PCR体系优化第44页,共50页，2024年2月25日，星期天利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化退火温度的优化第45页,共50页，2024年2月25日，星期天45oC55oC65oC溶解曲线扩增曲线1.95oCfor15min2.94oCfor10sec3.Gradientfrom45oCto65oCfor15sec4.72oCfor30sec5.83oCfor1sec6.PlateRead7.Gotoline239moretimes8.Meltingcurvefrom65oCto95oC,read

every0.2oC,hold1sec.退火温度的优化第46页,共50页，2024年2月25日，星期天实时荧光定量PCR应用定量：

DNA定量

RNA定量定性：

SNP分析基因型分析

RNA变异分析融解曲线分析第47页,共50页，2024年2月25日，星期天定量PCR应用I-实时定量

病原体定量检测转基因拷贝数的检测DNA定量——拷贝数研究（替代SouthernBlot）RNA定量——基因表达差异（替代NorthernBlot)

单个或多个基因地表达谱分析不同组织、器官不同时期不同处理第48页,共50页，2024年2月25日，星期