大学职业规划

九十六年度教育部

「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」

基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表

課程名稱:進階實驗課程B—細胞科技實驗

學分數:1學分(實驗)負責教師:黃昭祥、楊堉麟、葉怡玲

授課時間:96/08/04,05,11,12教室:尖端生物技術科技人才培育計畫實驗室

主題：細胞轉染技術與分析運用流式細胞儀觀察細胞程式性死亡PARTII九十六年度教育部

「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」

基因基因表現產物之分析SEAP:

實驗規劃基因表現產物之分析SEAP:

實驗規劃96well(一,二組)123456789101112ABPNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-MycBMP:1ugCDEFPNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-MycBMP:2ugGH96well(一,二組)12345678910111296well(三,四組)123456789101112ABPNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-MycBMP:4ugCDEFPM13CONNF-kBM13CONC-MycM13BMP2NF-kBM13BMP2C-MycBMP:1ugGH96well(三,四組)12345678910111296well(五,六組)123456789101112ABPM13CONNF-kBM13CONC-MycM13BMP2NF-kBM13BMP2C-MycBMP:2ugCDEFPM13CONNF-kBM13CONC-MycM13BMP2NF-kBM13BMP2C-MycBMP:4ugGH96well(五,六組)12345678910111訊息誘導出的轉錄因子（蛋白質）SEAP分泌型鹼性磷酸酵素SEAP基因BMP-2基因產物誘導SEAP基因表現（本次實驗）BMP-2基因SignaltransductionBMP2receptorpMyc-SEAPMycelement訊息誘導出的轉錄因子（蛋白質）SEAP分泌型鹼性磷酸酵素S訊息誘導出的轉錄因子（蛋白質）SEAP分泌型鹼性磷酸酵素SEAP基因BMP-2基因產物誘導SEAP基因表現（本次實驗）BMP-2基因SignaltransductionBMP2receptorpMyc-SEAPMycelement訊息誘導出的轉錄因子（蛋白質）SEAP分泌型鹼性磷酸酵素S實驗設計用意探討BMP-2基因表現是否可以誘導特定轉錄因子表現。實驗設計用意探討BMP-2基因表現是否可以誘導特定轉錄因子表轉殖基因表現的分析SEAPDETECTIONSYSTEM轉殖基因表現的分析SEAPDETECTIONSYSTEMPPT大学职业规划PPT大学职业规划PPT大学职业规划WHY原理簡介WHY原理簡介WHY冷光betterthan螢光？LOWBACKGROUND:HIGHS/NRATIOHIGHSENSITIVITY(duetoabovereasons)EVENBETTERTHANISOTOPE偵測波長決定偵測靈敏度靈敏Gamma-rayX-ray冷光螢光可見光WHY冷光betterthan螢光？LOWBAC偵測波長決定偵測解析度解析度Gamma-rayX-ray冷光螢光可見光0.1mm1nm0.1nmEMSFMSLMSmm偵測波長決定偵測解析度解析度Gamma-rayX-rPathwayProfilingSystemDetectionsystem一.材料

:AssayBuffer,chemiluminescentenhancer,5XDilutionBuffer,25mMCSPD（冷光受質）

Positivecontrolplacentalalkalinephosphatase

二.試驗前配置的workingsolution:1.1XDilutionBuffer:以

Mini-Qwater將5XDilutionBuffer做

1:5稀釋2.1.25mMCSPDSubstrateworkingsolution:將25mMCSPDchemiluminescentsubstrate與chemiluminescentenhancer做1:19稀釋PathwayProfilingSystemDetec各重要成分介紹各重要成分介紹

三.步驟

:1.將15mlsample加到96-wellplates的每個well裡2.再加入45ml的1XDilutionBuffer至每個samplewell中，混合均勻3.將step2

的dilutedsample在65Oc的水浴漕裡，反應30分鐘4.反應30分鐘後，再將96-wellplate放在冰上2~3分鐘回溫5.再加入60ml的Assaybuffer至每個samplewell裡，反應5分鐘6.再加入60ml的dilutedCSPDSubstrate至每個samplewell中，反應10分鐘7.並在step6之後的30分鐘內，以x-ray方式壓片/洗片（定影,顯影）

三.步驟:1.將15mlsample加到96-wePPT大学职业规划Why

heating65’C考Whyheating65’C考Why

AssaybufferRx5‘考WhyAssaybufferRx5‘考結果分析結果分析預期結果PNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-Myc（第一組為例）結論？結論？結論？結論？結論？預期結果PNRKNRKNRKNRK（第一組為例）結論？結論？預期結果結論？（第一組為例BMP:

1ug）（第二組為例BMP:

2ug）（第三組為例BMP:

4ug）PNRKCONNF-kBNRKCONC-MycNRKBMP2NF-kBNRKBMP2C-Myc預期結果結論？（第一組為例BMP:1ug）（第二組為例使用細胞NRK:NORMALRATKIDNEY(fibroblastcells)MDCK:MADINDARBYCANINEKIDNEY(tubule)M13:MURINEMESANGIALCELLS使用細胞NRK:NORMALRATKIDNEY(fiApoptosis組別實驗內容規劃

NRK

、NRK+植物萃取物A

NRK+植物萃取物B、NRK+H2O2

NRK+pCMV-BMP2

M13、M13+BSA

MDCK、MDCK+Mannitol、MDCK+H2O2

M13+H2O2

Apoptosis組別實驗內容規劃NRK、NRK+植物步驟首先將上清液移至15ml離心管。加入1ml的

PBSwash細胞，勿沖洗避免細胞剝落。將上清液移至步驟1的離心管。加入1ml的Tyrpsin在37℃反應5min。加入3ml的PBS將細胞洗下並移到步驟1的離心管。加入3ml的將細胞徹底洗下並移到步驟1的離心管。使用2000rpm離心細胞5min後，再以同轉數再離心1min。倒去上清液，並可使用200μl的Tip吸乾殘餘的PBS，移入

Flow管。加入100uL染劑,於RT培養30分鐘,持續震盪加入200μl的Bindingbuffer並充分混合均勻。上機分析，分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。

ReadFL-1(Annexin)andFL-2(PI)步驟首先將上清液移至15ml離心管。試劑置備與參數設定stainingsol’n配製：

32μlannexinV-FITC+800μLbindingbuffer+32μLPropidiumiodine(PI)=600μl

Flowcytometer設定參數P1-FSCLinP2-SSCLinP3–FL-1(Annexin-V)LogP4–FL-2(PI)Log試劑置備與參數設定stainingsol’n配製：DetectionofROSDetectionofROSIntroduction盡可能避光Introduction盡可能避光H2DCFDAIntracellularEsteraseOxidizedbyROS黃綠螢光DetectbyFlowcytometerROSDETECTIONPRINCIPLEH2DCFDAIntracellularOxidized黃PPT大学职业规划1.刺激時間終了後此盤刺激過的細胞不做任何變動並加入約50uM/ml（1mMstocksolution加100μl至各well）的H2DCF-DA

在37℃反應30min。2.把上清的medium移到15ml離心管。3.使用2mlPBSwash細胞然後把PBS移到步驟2的離心管。4.再加入2mlPBS並在室溫反應10min。5.將此PBS移到步驟2。6.加入0.5mltrypsin在37℃反應

5min。7.然後使用步驟2的離心管內的PBS+Medium的混合液沖洗細胞並移到步驟2。8.以2000rpm離心

5min。9.倒去上清液,再加入2mlPBS並mix細胞，使細胞打散。10.再以2000rpm離心5min。11.倒去上清液,然後再加入1mlFlowcytometer專用的PBS並混

合均勻。12.將步驟11移動到Flowcytometer專用的試管13.上機分析上機分析，分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。實驗步驟

1.刺激時間終了後此盤刺激過的細胞不做任何變動並加入約5NRKCONCON+DCFHCON+DCFH

植物萃取物A

+

DCFH

第1組實驗組別規劃

植物萃取物A

+

DCFH

植物萃取物A

+

DCFH

植物萃取物A對纖維母細胞氧化壓力的影響NRKCONCON+DCFHCON+DCFH植物萃取物ANRKCONCON+DCFHCON+DCFH第2組

植物萃取物B

+

DCFH

植物萃取物B

+

DCFH

植物萃取物B

+

DCFH

植物萃取物B對纖維母細胞氧化壓力的影響NRKCONCON+DCFHCON+DCFH第2組植物萃取NRKCONCON+DCFHCON+DCFHpCMV-BMP2+DCFH第3組BMP-2基因表現對纖維母細胞氧化壓力的影響pCMV-BMP2+DCFHpCMV-BMP2+DCFHNRKCONCON+DCFHCON+DCFHpCMV-BMPM13CONCON+DCFHBSA+DCFHH2O2+DCFHBSA+DCFHH2O2第4組(只做上面一排)H2O2與白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響M13CONCON+DCFHBSA+DCFHH2O2+DCFMDCKCONCON+DCFHMannitol+DCFHCON+D