转录组测序技术原理及应用

关于转录组测序技术原理及应用遗传的中心法则基因组—转录组—表观遗传组—蛋白组层次第2页,共53页，2024年2月25日，星期天什么是转录组？All

transcripts

All

mRNAs第3页,共53页，2024年2月25日，星期天RNA是解读基因组的关键RNAProteinPhenotypeGenotype

DNA第4页,共53页，2024年2月25日，星期天测序技术RNA-SeqSmallRNA测序降解组测序Non-codingRNA测序研究对象mRNASmallRNAmRNANon-codingRNA鉴定新分子OOOO表达谱研究OOOO基因结构分析O/XXXOEST测序O/XXXX

筛选分子标记

OOOX转录融合基因表达O/XXXXRNA测序技术第5页,共53页，2024年2月25日，星期天WorkflowofRNA-Seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第6页,共53页，2024年2月25日，星期天TotalRNA样品检测

Agilent2200检测OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

新型安捷伦2200TapeStation

系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解决方案。●

可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板●

快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果●

使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程●

样品用量少—每次运行仅需要不到2ul样品第7页,共53页，2024年2月25日，星期天检测报告-合格样品棉铃虫/果蝇第8页,共53页，2024年2月25日，星期天检测报告-不合格样品第9页,共53页，2024年2月25日，星期天WorkflowofRNA-Seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第10页,共53页，2024年2月25日，星期天真核mRNA的纯化mRNA的纯化主要通过的磁珠与生物素吸附原理从而分离纯化Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要是mRNA的3′的polyA与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。链霉亲合素包被磁珠+生物素标记Oligo（dT）25+poly（A）第11页,共53页，2024年2月25日，星期天原核mRNA的纯化AmbionMICROExpressKitLNA扣锁型探针第12页,共53页，2024年2月25日，星期天mRNA反转录---fragment+RT纯化过的mRNA样品加入1µl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1µl的stopbuffer终止反应。加入沉淀剂（NaAc糖原无水乙醇）沉淀产物。RTdscDNA第13页,共53页，2024年2月25日，星期天末端修复(防止自连）cDNA3′末端加AAdapter连接第14页,共53页，2024年2月25日，星期天第一天消化DNAmRNA的分离mRNA的打断cDNA的合成↓↓第二天末端修复↓↓加接头胶回收3’端加A第三天PCRPCR胶回收↓↓文库制备↓↓文库质量检测：Aligent2100：片段大小、纯度、浓度qPCR：片段大小、浓度手工检测：跑胶验证。第15页,共53页，2024年2月25日，星期天WorkflowofRNA-Seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第16页,共53页，2024年2月25日，星期天ApplicationRNA-Seq(单端测序---Quantification)RNA-Seq

(双端测序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofRNA-Seq17第17页,共53页，2024年2月25日，星期天RNA-Seq(Transcriptome)第18页,共53页，2024年2月25日，星期天WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome)生物信息学分析第19页,共53页，2024年2月25日，星期天RNA-Seq(Transcriptome)CharacterizethetranscriptomeinunparalleleddetailTechnique220RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)第20页,共53页，2024年2月25日，星期天RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)文库构建测序组装第21页,共53页，2024年2月25日，星期天Denovoassembleatranscriptome组装流程第22页,共53页，2024年2月25日，星期天数据产出统计及测序数据的成分和质量评估组装结果分析（Contig长度分布、Scaffold长度分布、Unigene长度分布）Unigene（transcript）功能注释Unigene的GO分类Unigene代谢通路分析预测编码蛋白框（CDS）Unigene表达差异分析（两个或两个以上样品）Unigene在样品间的差异GO分类（需两个或两个以上样品）和Pathway富集性分析Denovoassemblytranscriptome信息分析主要内容：第23页,共53页，2024年2月25日，星期天Denovoassemblytranscriptome信息分析流程第24页,共53页，2024年2月25日，星期天Unigenes的GO注释第25页,共53页，2024年2月25日，星期天Pathway分析第26页,共53页，2024年2月25日，星期天RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)cDNA文库构建测序比对到参考序列第27页,共53页，2024年2月25日，星期天Transcriptomeresequencing比对流程第28页,共53页，2024年2月25日，星期天比对统计基因表达注释基因差异表达分析基因结构优化可变剪接分析预测新转录本cSNP分析Transcriptomeresequencing信息分析主要内容第29页,共53页，2024年2月25日，星期天Transcriptomeresequencing信息分析流程第30页,共53页，2024年2月25日，星期天应用---优化转录组注释信息基因结构优化可变剪接鉴定基因融合鉴定RNA水平SNP分析第31页,共53页，2024年2月25日，星期天GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistribution优化基因结构

鉴定新的转录本Paired-End(PE)ReadsReads比对到参考序列基因间区域第32页,共53页，2024年2月25日，星期天鉴定可变剪接（AlternativeSplicing）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA第33页,共53页，2024年2月25日，星期天鉴定基因融合PairedReadsSingleReadsGeneAGeneB第34页,共53页，2024年2月25日，星期天分析RNA水平SNP转录组重测序比对软件：SOAPDenovo转录组测序:组装软件：SoapDenovo比对软件：SoapSNP第35页,共53页，2024年2月25日，星期天36转录组研究技术横向比较TechnologyTilingArraycDNAorESTsequesingTranscriptomeSequencingPrincipleHybridizationSangersequencingNext-GensequencingResolutionFromseveralto100SinglebaseSinglebaseThroughputHighLowHighRelianceongenomicsequenceYesNoInsomecasesBackgroundnoiseHighLowLowApplicationSimutaneouslymaptranscribedregionsandgeneexpressionYesLimitedforexpressionYesDynamicrangetoquantifygeneexpressionlevelUptoafew-hundredfoldNotpractical>8,000-foldAbilitytodistinguishdifferentisoformsandallelicexpressionLimitedYesYes第36页,共53页，2024年2月25日，星期天转录组测序的优势RNA测序与芯片检测基因数比较RNA测序与芯片检测基因的表达量分布Technique1第37页,共53页，2024年2月25日，星期天GenomeRes2010Case

实验材料收集：

叶片，花序,果实,根时间点：0,4,8,12,16,20和24h将每个时间点采集的样品均匀混合测序策略：

Illumina测序，1Gdata第38页,共53页，2024年2月25日，星期天1.Highlight2.Heat3.Cold4.Salt5.Drought抗逆相关可变剪接第39页,共53页，2024年2月25日，星期天外包膜蛋白16(AT2G28900)Intron-retentionControlLowTemperatureResistance低温胁迫相关的AS低温胁迫下这个内含子和对照相比被保留了下来，揭示了可变剪接有重要功能。第40页,共53页，2024年2月25日，星期天AS调节机制CCA1生物钟相关基因，例如调节气孔的开关等第41页,共53页，2024年2月25日，星期天RNA-Seq单端测序（Quantification）等同于数字表达谱(DGE)第42页,共53页，2024年2月25日，星期天WorkflowofRNA-Seq单端测序（Quantification）生物信息学分析第43页,共53页，2024年2月25日，星期天RNA-Seq单端测序（Quantification）生物信息分析内容测序数据评估筛选差异表达基因表达模式聚类分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作网络分析第44页,共53页，2024年2月25日，星期天RNA-Seq单端测序（Quantification）信息分析流程第45页,共53页，2024年2月25日，星期天RNA-Seq与基因芯片优缺点比较技术优点缺点RNA-seq1）检测基因数比基因芯片多25%2）定量准，可重复性高（重复相关系数≥0.99）3）数字化信号，无背景噪音，无交叉杂交4）高、低丰度基因均可检测5）不受研究物种限制，模式生物和非模式生物均可检测6）数据可与时俱进，即随数据库更新而更新7）具有较好的分析兼容性，数据格式与芯片相同，可与芯片的分析软件兼容1）样本要求量比基因芯片多2）数据量大，需要具备一定的生物信息分析基础，才能更好的挖掘数据蕴含的丰富信息基因芯片1）平台应用较早2）信息分析软件较多3）有些平台要求样品量少1）检测灵敏度较低、重复性差、检测阈值较狭窄2）有背景噪音，假阳性率＞1%3）受物种限制，只能检测部分模式生物4）受基因拷贝数限制，无法检测出低丰度基因5）只能检测已知转录本，无法检测出新转录本6）受数据库数据所限，因探针依靠现有数据库或比较旧的版本的数据库来设计的，可能出现注释不准确的情况第46页,共53页，2024年2月25日，星期天casePlantPhysiology2010取样：

选取在成熟季节开花后

5,10,和15个星期葡萄分别代表葡