酶与细胞的固定化技术

第一节酶的固定化水不溶性载体水溶性酶水不溶性酶（固定化酶）固定化技术第2页,共70页，2024年2月25日，星期天固定化酶是指借助于物理或化学方法，将酶固定在载体上，并在一定的空间内进行催化反应的酶。固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体。第3页,共70页，2024年2月25日，星期天固定化酶的特点稳定性提高，使用寿命延长可得到高纯度、高产量的产品可以连续化生产操作反应的最优化控制成为可能再生产利用第4页,共70页，2024年2月25日，星期天缺点酶活力有一定损失，初始的投资大。只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜。与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定。第5页,共70页，2024年2月25日，星期天一、酶的固定化方法1．物理吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。载体类别：天然无机载体：活性炭，硅藻土，硅胶等。有机载体：淀粉，纤维素，谷胶原等。

第6页,共70页，2024年2月25日，星期天第7页,共70页，2024年2月25日，星期天第8页,共70页，2024年2月25日，星期天第9页,共70页，2024年2月25日，星期天2、包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。分为：（1）网格型（2）微囊型第10页,共70页，2024年2月25日，星期天（1）网格型

将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。第11页,共70页，2024年2月25日，星期天载体材料：合成高分子化合物：聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，光敏树脂天然高分子多糖类：淀粉，明胶，海藻酸，角叉菜胶。第12页,共70页，2024年2月25日，星期天

聚丙烯酰胺包埋制备固定化酶的过程：将酶溶液加入到含有丙烯酰胺（单体）和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（交联剂）的溶液中，再加入二甲氨基丙腈（加速剂），同时加入过硫酸钾（引发剂）混合，于25℃保温10min，即得含酶凝胶，将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒，于低温储存或冷冻干燥。第13页,共70页，2024年2月25日，星期天（2）微囊型将酶或微生物菌体包埋在高分子半透膜中的微囊内称为微囊型包埋法。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。第14页,共70页，2024年2月25日，星期天①界面沉淀法利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜从而将酶包埋。②界面聚合法利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。第15页,共70页，2024年2月25日，星期天

③二级乳化法酶溶液先在高聚物（乙基纤维素、聚苯乙烯等）有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物固定化后，每个固体球内包含多滴酶液。④脂质体包埋法采用双层脂质体形成的极细球粒包埋酶。第16页,共70页，2024年2月25日，星期天3、结合法通过选择适宜的载体，通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。离子键结合法共价键结合法第17页,共70页，2024年2月25日，星期天离子键结合法

通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。常用载体:DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶使用注意：pH、离子强度、温度优缺点：操作简便，条件温和，酶活力回收率高；易受缓冲液种类和pH影响，易脱离。第18页,共70页，2024年2月25日，星期天共价键结合法通过共价键将酶蛋白的侧链基团与载体的官能团结合的固定化方法。可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键(非活性中心基团)常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体优缺点：操作复杂，酶结构性质变化，回收率低，不适用于微生物细胞固定；不易脱落。第19页,共70页，2024年2月25日，星期天首先载体上引进活泼基团关键然后活化该活泼基团最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键共价键结合法制备固定化酶的“通式”第20页,共70页，2024年2月25日，星期天重氮法叠氮法烷基化反应法硅烷化法溴化氰法载体活化的方法第21页,共70页，2024年2月25日，星期天①重氮法

是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8∽9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。反应示意式如下第22页,共70页，2024年2月25日，星期天目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等该方法需要载体具有芳香族氨基第23页,共70页，2024年2月25日，星期天②叠氮法对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。第24页,共70页，2024年2月25日，星期天③溴化氰法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。第25页,共70页，2024年2月25日，星期天④烷基化反应法

含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。第26页,共70页，2024年2月25日，星期天4、交联法

借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。第27页,共70页，2024年2月25日，星期天酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶第28页,共70页，2024年2月25日，星期天交联法常用试剂常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)。双重固定法吸附交联法交联包埋法第29页,共70页，2024年2月25日，星期天将酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，热处理也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。5、热处理法第30页,共70页，2024年2月25日，星期天各种固定方法的特点比较第31页,共70页，2024年2月25日，星期天复合载体PEI-SIO2的制备首先对硅胶进行活化处理：取5g硅胶至于30ml甲烷磺酸水溶液控制温度在102℃，搅拌活化4h，洗涤，抽滤后真空干燥24h即可；然后使硅胶发生氯丙基化，将活化后的硅胶以二甲苯为溶剂，加入少量的水，与γ-氯丙基三甲氧基硅烷在80℃反应6h，抽滤后的产物在索氏抽屉器中用甲苯抽屉24h，以除去γ-氯丙基三甲氧基硅烷，分离后产物经真空干燥，所制产物为氯丙基化的硅胶（CP-SIO2）；第32页,共70页，2024年2月25日，星期天最后，准确称量1g氯丙基化的硅胶，至于一定浓度的聚乙烯亚胺水溶液中，于一定的温度下反应一段时间，用大量蒸馏水冲洗产物，抽滤，真空干燥后制得PEI-SIO2复合载体。第33页,共70页，2024年2月25日，星期天第34页,共70页，2024年2月25日，星期天第35页,共70页，2024年2月25日，星期天称取0.5g经干燥的复合载体PEI-SIO2，加入适量的戊二醛溶液，搅拌并在室温条件下反应1h，产物用蒸馏水冲洗后抽滤，再加入30ml经磷酸盐缓冲溶液稀释过的脂肪酶液，在恒温水浴振荡器中于给出的温度下震荡一定的时间，即可制的固定化的脂肪酶。第36页,共70页，2024年2月25日，星期天Table1IndependentvariablesandtheirlevelsforcentralcompositedesignIndependentvariablescodesVariablelevels-10+1MethanolmolarratioX1246Enzymeamount(%)X2369HexaneweightratioX30.30.60.9Temperature(℃)X4304050第37页,共70页，2024年2月25日，星期天IndependentvariablescodesVariablelevels-2-10+1+2Enzymeamount(%)X112345Addedwater(v/v)X2246810MethanolmolarratioX323456Reactiontemperature(℃)X42535455565Reactiontime(h)X548121620第38页,共70页，2024年2月25日，星期天RunX1X2X3X4Truemodel(%)RSMmodel(%)Error(%)1-1-10047.446.661.562-110055.7453.843.4131-10045.6847.303.554110060.8661.320.75500-1-171.9371.350.81600-1167.9367.980.077001-170.8670.470.068001172.1772.410.339-100-153.7455.583.4210-100154.3754.340.0611100-157.5859.112.6612100159.2758.910.61130-1-1066.0965.950.21140-11054.155.151.941501-1063.4563.980.7416011076.6178.322.2317-10-1046.3445.12.6818-101053.3750.714.981910-1056.4552.996.1320101055.850.938.73210-10-171.4468.683.86220-10170.1566.535.1623010-180.477.843.1824010182.0378.574.2225000089.3589.210.1526000089.6589.210.4927000091.0289.211.99第39页,共70页，2024年2月25日，星期天Y=-174.942+53.543X1+9.479X2+127.56X3+4.143X4+0.285X1X2-3.198X1X3+0.013X1X4+6.986X2X3+0.024X2X4+0.442X3X4-6.605X12-1.167X22-142.839X32-0.058X42第40页,共70页，2024年2月25日，星期天第41页,共70页，2024年2月25日，星期天第42页,共70页，2024年2月25日，星期天Fattyacidmethylestercontetnt(%)Rentiontime(min)Content(%)7-Hexadecanoicacidmehtylester(C17H32O2)6.590.72Hexadecanoicacidmehtylester(C17H34O2)6.7314.829,12-Octadecadienoicacidmethylester(C19H34O2)8.1835.799-Octadecadienoicacidmethylester(C19H36O2)8.2440.96Octadecadienoicacidmethylester(C19H38O2)8.457.511-Eicosenoicacidmethylester(C21H40O2)10.260.07Eicosenoicacidmethylester(C21H42O2)10.530.14第43页,共70页，2024年2月25日，星期天二、固定化酶的性质

1、固定化对酶稳定性的影响大多数情况下，具有较长的操作寿命和保存寿命。原因：酶固定化使其活性构象的牢固性增加，酶分子与载体的多方位连接降低了酶分子的伸展变性。酶固定化能降低自身降解的程度载体的保护使得酶抗不良环境因素的影响的能力增强。第44页,共70页，2024年2月25日，星期天固定化酶稳定性升高表现在：热稳定性增强对变性剂、抑制剂的耐受性提高对蛋白酶抵抗能力增加、储存稳定性和操作稳定性有所增强。第45页,共70页，2024年2月25日，星期天2、最适温度固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有明显的变化。第46页,共70页，2024年2月25日，星期天1）载体带负电荷，pH向碱性方向移动。

微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。最适pH值

第47页,共70页，2024年2月25日，星期天载体带正电荷，pH向酸性方向移动。（2）产物性质对体系pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低。第48页,共70页，2024年2月25日，星期天4、底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。5、米氏常数固定化酶的表观米氏常数随载体的带电性能而变化。（1）载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。（2）载体与底物电荷相反，静电作用，Km'<Km第49页,共70页，2024年2月25日，星期天三、固定化酶的应用1、工业生产中的应用（1）氨基酰化酶（2）葡萄糖异构酶（3）延胡索酸酶第50页,共70页，2024年2月25日，星期天2、酶电极 （1）葡萄糖电极 半透膜 酶胶层

感应电极

酶电极示意图第51页,共70页，2024年2月25日，星期天葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氢醌葡萄糖氧化酶氢醌 醌＋2H＋＋2e－Pt铂电极第52页,共70页，2024年2月25日，星期天第二节细胞及细胞器的固定化细胞固定化：通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程。固定化活细胞或固定化增值细胞：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。第53页,共70页，2024年2月25日，星期天一、微生物细胞固定化固定微生物细胞时，操作简便易行，对细胞的生长、繁殖和新陈代谢没有明显的影响，但吸附力较弱，吸附不牢固，细胞容易脱落。吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法，主要是因为动物细胞大多数具有附着特性。吸附法是制备固定化植物细胞：硅藻土、多空玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料、纤维素等。第54页,共70页，2024年2月25日，星期天（2）包埋法将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法（凝胶包埋法、半透膜包埋法）。琼脂糖凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法第55页,共70页，2024年2月25日，星期天2、固定化微生物细胞的特点固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。固定化微生物细胞保持了原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢。发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用提高了细胞密度，提高产率。第56页,共70页，2024年2月25日，星期天3、固定化微生物细胞的应用发酵生产各种胞外产物。利用固定化微生物细胞与各种电极结合制成微生物电极。呼吸活性测定型传感器：利用固定在高分子膜上的微生物细胞的呼吸作用，测定氧气的消耗和二氧化碳的生成，从而确定被测定物质的量。电极活性测定型传感器：利用固定在膜上的微生物细胞的新陈代谢作用，测定电极活性物质的量的变化，从而确定样品中欲测物质的含量。第57页,共70页，2024年2月25日，星期天二、植物细胞固定化（1）植物细胞固定化方法吸附法：一般将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。包埋法：将植物细胞包埋在琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶中。第58页,共70页，2024年2月25日，星期天（2）固定化细胞的特点固定化植物细胞发酵可以简便地在不同的培养阶段更换不同的培养液，有利于生产各种所需的次级代谢物。提高植物细胞的存活率和稳定,可连续使用较长的时间，大大缩短生产周期，提高产率.不容易聚集成团,有利于产品的分离纯化，提高产品的质量。第59页,共70页，2024年2月25日，星期天（3）固定化植物细胞的应用①制造人工种子细胞全能理论：在一定的条件下，细胞会生长、繁殖长成一颗完整的植株。通过植物细胞培养技术，可以由一粒种子快速繁殖得到大量细胞，再通过固定化技术进行人工种子的研制，获得大量具有相同遗传特性的植株。

②固定化植物细胞可以用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物。（胞外产物）第60页,共70页，2024年2月25日，星期天三、动物细胞固定化1、动物细胞固定化的方法①吸附法常用的吸附固定化载体转瓶：由玻璃或塑料制成，其表面经过一定的方法处理可带上电荷。微载体：颗粒细小的固定化载体，由带有表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。中空纤维：由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。第61页,共70页，2024年2月25日，星期天②包埋法包埋法一般适用于悬浮细胞

凝胶包埋法：利用多孔凝胶为载体将动物细胞包埋固定化。琼脂糖凝