营养调控与基因表达

关于营养调控与基因表达

随着分子生物学的发展及其在营养学中的应用,从分子水平上弄清养分的代谢过程和规律,准确确定动物群体及个体的营养需要,掌握养分摄入过量及缺乏的后果,预防和治疗营养代谢疾病以及解决其他营养问题将成为可能。营养与基因表达的关系及其作用机制已成为分子生物学的重要研究内容及营养学的新兴研究领域。该领域的研究在过去5～10年中取得了较大进展。营养和基因表达的一般关系表现为两个方面:一是养分的摄入量影响基因表达;二是基因表达的结果影响养分的代谢途径和代谢效率,并决定营养需要量。第2页,共45页，2024年2月25日，星期天Animalperformance(meat,milk,egg,wool,etc)(growth,development,etc)Genotype(geneonchromosome)Environment(nutrition,

ambient,management)Inter-relationshipsbetweengenotype,environmentandanimalproduction第3页,共45页，2024年2月25日，星期天

基因表达：是指编码某种蛋白质的基因从转录、mRNA的加工与成熟、RNA的翻译、蛋白质的加工,到活性(功能)蛋白质的形成的过程(Goodridge,1994)。基因表达调控包括转录调控、RNA加工调控、RNA转运调控、翻译调控、mRNA稳定性调控及翻译后的调控。每一个调控点都与养分直接或间接有关(Clarke,1992)。

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研究表明,营养对基因表达的作用主要发生在转录或翻译前水平上,对翻译后的影响较小(Berdanier,1998)。研究表明,真核细胞的mRNA的5’和3’端的碱基不能翻译成蛋白质,称为非编码区(UTR)。UTR含有控制mRNA的腺苷聚合、稳定性、在细胞中的分布定位以及翻译的调节信号,对基因表达的调节起着核心作用(Kozak,1992;Choi,1995)。养分对基因表达的调控作用是通过UTR,特别是3’UTR实现的。第5页,共45页，2024年2月25日，星期天NutrientintakeGeneexpressionDNA

RNA

proteinNutrientuptakepathwayandmetabolismNutrientrequirementInter-relationshipsofnutritionandgeneexpression第6页,共45页，2024年2月25日，星期天Which

genes,particularlythoseinvolvedincontrolofmetabolism,growthandpartitionareregulatedbynutrition?Howdonutrientsanddietregulatetheexpressionofspecificgenes?HowistheexpressionofspecificgeneproductsinvolvedinmetabolismandchannellingofnutrientsFundamentalquestions第7页,共45页，2024年2月25日，星期天DietaryconstituentDirectregulationPhysiologicalmodulationSecondarymediatorRegulatedtranscription

mRNAProteinResponsivegenesRegulatedtranscription

Directandindirecteffectsofnutritiononregulationofgeneexpression第8页,共45页，2024年2月25日，星期天DNARNA3’polyadenylationtranscription5’CapAAA200SplicingAAA200MaturemRNANucleusCytoplasmPlasmamembraneExons1 2 3 4PromoterSomemicronutrientshormonesSignaltransductionpathwaysIntracellularreceptorsAAAmRNATranslocationPolyribosomesProteinTranslation第9页,共45页，2024年2月25日，星期天CriticalcontrolpointsTranscriptionalregulationActivation,transcriptionalspeedPost-transcriptionalregulationmRNAprocessing(splicing)mRNAtransportation,localizationmRNAstabilitymRNAtranslationPost-translationregulation第10页,共45页，2024年2月25日，星期天Post-transcriptionalcontrolofgeneexpression(3)(1)(2)第11页,共45页，2024年2月25日，星期天Regulatorysignalsintheuntranslatedregionsandtheirinteractionswithnutrition第12页,共45页，2024年2月25日，星期天InteractionbetweennutritionandgeneexpressionNutritionalregulationofgeneexpressionMolecularbiologicalapproachestonutrient-geneinteractions

Effectsofenvironmentalfactorsonnutrient-geneinteractions第13页,共45页，2024年2月25日，星期天Principles:

isolation&estimationofmRNAmRNAistheprimaryproductofageneandmediatesitsexpressionasprotein.Inmanyinstances,nutrienteffectsontheexpressionofproteinreflectchangesintheconcentrationoftheirmRNA.ItisalsofrequentlyeasiertodeterminemRNAconcentrationsthantoestimatethecorrespondingproteins.第14页,共45页，2024年2月25日，星期天mRNAcanreadilybeconvertedintotheirequivalentDNAbyfirstsynthesizingacomplementarystrandofDNA(cDNA)andthenasecondstrandcomplementarytothefirst.DNAismucheasiertomanipulatethanRNAinplasmidsorbyPCR.ThecDNAcanbesequencedtoproteinsequenceinformationwhichcanusedinstructuralstudiesandindevelopmentofimmunologicalmethodsofproteinestimation.Principles:

isolation&estimationofmRNA第15页,共45页，2024年2月25日，星期天ThesynthesisofindividualmRNAisrarelybydirectinteractionofanutrientwithagene.Instead,controlisgenerallymediatedthroughoneormoreproteinsreferredtoastranscriptionfactors.Thesebindtoregulatoryregionsofthegeneanddeterminetheefficiencyofitstranscription.Principles:

isolation&estimationofmRNA第16页,共45页，2024年2月25日，星期天MaintechniquesHybridizationIsolationofmRNAProbesEstimationofmRNANorthernblottingRibonucleaseprotectionaaasyPCR,realtime-PCRDNAsequencingCloneImportant

understandinghowanutrientinfluencesexpressionofaparticulargenerequiresastudyofthefactorswhichbindtothatgene’sregulatoryregion第17页,共45页，2024年2月25日，星期天InteractionbetweennutritionandgeneexpressionNutritionalregulationofgeneexpressionMolecularbiologicalapproachestonutrient-geneinteractionsEffectsofenvironmentalfactorsonnutrient-geneinteractions第18页,共45页，2024年2月25日，星期天Animalperformance(meat,milk,egg,wool,etc)(growth,development,etc)Genotype(geneonchromosome)Environment(nutrition)Inter-relationshipsbetweengenotype,environmentandanimalproductionambientmanagement第19页,共45页，2024年2月25日，星期天Nutritionandgeneexpression第20页,共45页，2024年2月25日，星期天FeedindustryAnimalproductionEffluentLessslurryLessodourAnimalbiotechnologyConsumerproducts-MilkMeatEggFishMicrobialbiotechnologySilageinoculantsProbioticsEnzymes

AminoacidsGrowthenhancersEnvironmentalbiotechnologyChemicalorbiotechnologypre-treatmentConservationChemicalorbiotechnologypre-treatmentBetterproteinoraminoacidsCurrentcropsPlantbiotechnologyBy-productsConsumerproducts-

FlourWhiskyBeerFood/drinkindustryChemicalindustryChemicals

StarchGlutenAdhensivesOilsBy-products第21页,共45页，2024年2月25日，星期天一、能量蛋白质对基因表达的影响

生长激素(GH)是控制动物出生后生长的主要激素。GH对生长的控制必须通过GH受体(GHR)及类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的作用才能实现,IGF-Ⅰ是GH促进生长的最重要的介导物(Cohick,1993)。哺乳动物体内存在另一种IGF,叫IGF-Ⅱ,主要在胚胎和胎儿组织产生,是胚胎和胎儿的主要生长因子。IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的大多数作用均需要IGF-Ⅰ受体(Ⅰ型受体)参与(Straus,1994)。除GH外,营养状况是调控IGF-Ⅰ的重要因素。大多数动物试验均表明,营养不良导致的生长受阻往往伴随有血浆GH水平的升高,而不是下降(Buonomo,1991;;Vance,1992)。能量蛋白质对生长调节基因表达的影响可能具有组织特异性。第22页,共45页，2024年2月25日，星期天二、氨基酸对基因表达的影响

氨基酸除参与IGF-Ⅰ和GHR基因表达的调节外,还与多种其他基因表达的调节有关。Marten(1994)报道,在大鼠肝细胞培养基质中去掉氨基酸后促进了数个基因的表达,提高幅度最大的是CHOP基因。

CHOP是一分子量很小的核蛋白,为转录因子C/EBP(CCAAT/促进子结合蛋白)的同源蛋白。CHOP通过与C/EBP结合成二聚体而参与多种基因表达的调节(Cao,1991;Birkenmeier,1989;Umek,1991)。

Bruhat(1997,1999)用人体细胞培养证明,低浓度的亮氨酸明显提高CHOP基因的表达,其机制是提高了基因的转录率和CHOPmRNA的稳定性。其他氨基酸,如赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸的限制也可促进CHOP的表达。Wang(1996)认为,氨基酸缺乏导致基因表达的改变并不是氨基酸本身的作用,而是氨基酸浓度下降导致异常蛋白质合成的结果。但Bruhat(1997,1999)认为,低浓度氨基酸诱导CHOP的表达不是细胞应激的结果,而是氨基酸本身的直接作用。他们已经找到了CHOP基因上氨基酸缺乏时促进转录的两种转录因子。氨基酸调控CHOP基因表达的作用机制还需深入研究。

第23页,共45页，2024年2月25日，星期天三、脂肪酸对基因表达的影响1脂肪合成酶系很早以前人们就知道日粮脂肪有抑制肝脏的脂肪合成作用。除了脂肪对脂肪合成酶系的直接作用(如脂酰辅酶A是ACC的变构抑制剂)外,脂肪可以调节生脂酶的表达是抑制生脂作用的重要原因。

LCFA是通过肉碱棕榈酰转移酶(CPT)系统进入线粒体内进行氧化供能的,而CPT系统主要由位于线粒体膜外侧的CPTⅠ和位于膜中间的肉碱-酰基肉碱转移酶以及位于膜内侧CPTⅡ等三部分组成,在这个过程中CPTⅠ是控制LCFA进入线粒体的主要位点(McGarry等,1989)。进入线粒体后的LCFA氧化供能则受到3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶的限制,因此这两种酶是影响LCFA利用的关键环节,而它们的基因表达又受到日粮中LCFA的调控。第24页,共45页，2024年2月25日，星期天

一些实验已证明,n-6和n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)能抑制肝脏脂肪合成所需的多种酶。受PUFA抑制的生脂酶包括脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、硬脂酰CoA脱饱和酶、L-丙酮酸激酶(L-PK)和S14蛋白(参与脂肪代谢的一种蛋白质,主要存在于脂肪酸合成作用非常活跃的肝脏、脂肪组织和乳腺)(Blake,1990;Landschulz,1994;Ntambi,1992)。脂肪酸抑制作用的大小与链长和饱和程度有关。鱼油中的脂肪酸抑制作用最强。18:2(n-6)和18:3(n-3)必须经过脱饱和作用分别转化为18:3(n-6)和18:4(n-3)后才具有抑制作用(Clarke,1990)。第25页,共45页，2024年2月25日，星期天Raclot(1999)总结了不同PUFA对基因表达的调节作用,并认为PUFA对特异基因表达的调控具有组织特异性和作用位点特异性。PUFA的主要作用机制是抑制基因转录,降低mRNA水平。研究表明,PUFA可直接与基因上的转录因子结合。目前已经鉴定出了S14和L-PK基因上PUFA的作用位点(Jump，1999;Liimatta,1994)。第26页,共45页，2024年2月25日，星期天SCD1:硬脂酰辅酶A脱饱和酶,FAS:脂肪酸合成酶,PK:丙酮酸激酶,ACC:乙酰辅酶A羧化酶,GLUT4:胰岛素反应性葡萄糖转运蛋白4,PEPCK:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,ACO:乙酰辅酶氧化酶,CCP:细胞色素P4504A2,GK:葡萄糖激酶,ME:苹果酸酶,APOA-1:脱脂蛋白A-1,LPL:脂蛋白脂酶,HSL:激素敏感脂酶,C/EBPα:CCAAT/促进子结合蛋白α,PPARα:过氧化质体增殖激活受体α,aP2:脂肪细胞脂质结合蛋白,ATP-CL:ATP-柠檬酸裂解酶,G6PDH:6-磷酸葡萄糖脱氢酶;第27页,共45页，2024年2月25日，星期天葡萄糖转运蛋白

葡萄糖只有在葡萄糖转运蛋白的作用下进入细胞膜后才能进一步代谢。已知动物体内存在多种葡萄糖转运蛋白(从GLUT1到GLUT5,GLUT7)。编码这些蛋白质的基因的表达程度决定了葡萄糖进入细胞的数量。

第28页,共45页，2024年2月25日，星期天

Long1996)、Tebbey(1994)等的研究表明：脂肪酸,特别是花生四烯酸(ADA)是脂肪细胞葡萄糖转运系统的生理调节物。ADA可以抑制T细胞中硬脂酰-CoA脱饱和酸(Long,1996)、肝脏脂肪酸合成酶(Clarke,1992)、3T3-L1脂肪细胞中GLUT4(Tebbey,1994)等基因的转录率。Tebbey等(1994)证明,ADA可以调节GLUT4基因的表达。将完全分化的3T3-L1脂肪细胞放入ADA中培养48小时,则GLUT4mRNA的量下降了90%,其原因是GLUT4基因的转录下降了50%,GLUT4mRNA的稳定性也明显降低。第29页,共45页，2024年2月25日，星期天四、碳水化合物对基因表达的影响

高碳水化合物饲粮促进脂肪的合成,其作用涉及基因转录、mRNA的加工和稳定性(Katsurada,1990;Clarke,1992;Towle,1997)。大鼠肝细胞在蔗糖介质中培养2小时,脂肪酸合成酶及S14mRNA水平增加10～15倍;绝食大鼠饲喂高碳水化合物饲粮后,肝中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶mRNA量在4～6小时内提高7倍。此外,碳水化合物对ATP-柠檬酸裂解酶、甘油-3-磷酸乙酰转移酶、硬脂酰CoA脱饱和酶等基因表达的促进作用也是发生在转录调节环节(Towle,1997)。碳水化合物对S14基因(Burmeister,1991)、apoB基因(Baum,1990)的调节作用发生在mRNA的加工环节上,而对肝脏苹果酸酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶等的作用是通过提高mRNA的稳定性实现的(Dozin,1986;Iritani,1992;Moustad,1991)。第30页,共45页，2024年2月25日，星期天

碳水化合物中起调节作用的关键成分是葡萄糖,但目前还不清楚是由于葡萄糖的直接作用还是因为激素分泌改变的结果。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是肝和肾中糖元异生的关键酶,它的基因转录区起始位点上游500bp内含有许多调节单元,可与代谢信号相呼应;该基因的表达可受到日粮营养成分的调控。营养成分对PEPCK的调控主要是通过与其启动子作用而实现的。有人认为,葡萄糖的直接作用是关键,胰岛素对生脂基因的调节是通过葡萄糖实现的(Ferre,1999)。当日粮中含有大量糖类时,由于胰岛素的作用而抑制了PEPCK基因的转录,导致其水平下降。当禁食或日粮中含低糖时,情况则刚好相反。目前已鉴别出了L-PK、S14和ACC基因中的葡萄糖作用区Girard,1997)。然而,某些基因的最大表达可能需要葡萄糖与激素的协同作用(Clarke,1992;Vaulont,1994)。第31页,共45页，2024年2月25日，星期天五、矿物质和维生素对基因表达的影响第32页,共45页，2024年2月25日，星期天第33页,共45页，2024年2月25日，星期天铁：铁的吸收与转运需要运铁蛋白及其受体的参与,而铁蛋白是铁在体内的贮备形式和高剂量铁的解毒形式,两种蛋白的表达均受翻译后调节机制的调控。运铁蛋白受体mRNA的3’UTR上含有铁调节区(IRE)。缺铁时,铁调节蛋白(IRP)就与IRE结合,保护mRNA使其不被RNA裂解酶降解,从而提高运铁蛋白受体的水平。当有铁存在时,IRP就脱离mRNA分子,失去保护的mRNA不稳定,其翻译率下降,从而导致运铁蛋白受体的合成量减少,铁的吸收率下降(Klausner,1989;Koeller,1989;Theil,1994)。铁的状况并不影响运铁蛋白受体基因的转录(Klausner,1989)。但Zakin(1992)的综述指出,虽然很多组织都含有运铁蛋白基因,但不同组织的基因含有不同的转录调节因子,使运铁蛋白基因的表达具有明显的组织特异性。第34页,共45页，2024年2月25日，星期天第35页,共45页，2024年2月25日，星期天硒

硒以半胱氨酸硒的形式参与硒蛋白(如GSH-Px,碘化甲状腺氨酸-5’-脱碘酶)的组成。在硒蛋白翻译过程中,UGA密码子不再作为终止信号,而是作为半胱氨酸硒的编码信号,从而在蛋白中插入半胱氨酸硒(Shen,1993)。

Burk(1993)、Bermano(1995)研究表明,日粮硒水平不但能够调节硒蛋白的含量与活性,而且可以调节相应的mRNA的量。但对不同组织,不同硒蛋白及其mRNA对不同硒水平的敏感程度存在差异。如,在硒耗竭时,磷脂过氧化氢GSH-PxmRNA的降解率不受影响,但胞液GSH-PxmRNA的降解率下降。因此,缺硒时,二种酶的活性不同(Bermano,1996a)。不同硒蛋白mRNA的3’UTR结构的差异是决定mRNA翻译程度及对硒缺乏的敏感性的关键因素(Bermano,1996b)。第36页,共45页，2024年2月25日，星期天ThyroidAntioxidantXenobioticmetabolismImmunityFertilityMyopathiesAnticancerIll-thrivengrowthH|

Se|CH2|CH/\…HNCO…MetabolicpathwaysanddiseaseassociatedwithSeinanimals.AtphysiologicalpHover99%oftheSeintheformSe-whichcanactasanefficientredoxcatalyst(Combs&Combs,1986)第37页,共45页，2024年2月25日，星期天SeSelenoproteinPcGSH-PxSe-bindingproteins(58,56and14kDa)phGSH-PxeGSH-PxgiGSH-PxSpermcapsuleselenoprotein(mouse)IDIIDIIIDIIISelenoproteinWThioredoxinreductaseSelenoproteinswhichhasbeenpurifiedformammaliancells

Key:cGSH-Px,cystolicglutathioneperoxidase;phGSH-Px,phospholipidhydroperoxideGP;eGSH-Px,extracellularGP;giGSH-Px,gastrointestinalGP;IDI,IDIIandIDIII,typeI,IIandIIIiodothyroninedeiodinases(Arthur,1997)第38页,共45页，2024年2月25日，星期天Weightgainincatfishfedacasein-baseddietsupplementedwithsodiumselenite,selenomethionineorselenoyeast(Se-Plex50)(LovelandWang,1997)第39页,共45页，2024年2月25日，星期天Glutathioneperoxidase(GSH-Px)andSecontentinliverofcatfishfedacasein-baseddietsupplementedwithsodiumselenite,selenomethionineorselenoyeast(Se-Plex50)(LovelandWang,1997)第40页,共45页，2024年2月25日，星期天第41页,共45页，2024年2月25日，星期天锌：

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)可以结合多种金属元素,是元素转运、维持细胞中的元素平衡、防止重金属中毒所必需的蛋白质。

Cui(1998)用大鼠试验表明,饲粮缺锌可明显降低肝脏、