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文档简介
几丁寡糖联合顺铂对肺癌A549细胞及其移植瘤的影响目的:1.通过体外细胞实验及体内动物实验,分析中药降解产物几丁寡糖单独应用及与顺铂联合应用对肺腺癌A549细胞增殖、迁移、凋亡能力的影响以及对裸鼠移植瘤的作用,探讨两药联合在抗肿瘤作用方面是否具有良好的协同效果,为未来几丁寡糖在抗肿瘤治疗领域中的开发应用及临床转化,提供实验基础及理论依据。材料与方法:本研究采用三组药物(几丁寡糖组、顺铂组、几丁寡糖联合顺铂组)作用于人肺腺癌A549细胞系,通过MTS实验、细胞划痕实验、transwell小室迁移实验及流式细胞凋亡实验,对比观察各药物组对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及凋亡等生物学行为的影响;同时应用肺腺癌A549细胞对裸鼠进行皮下移植瘤造模,待造模成功后,按照给药的不同将裸鼠随机分为四组,分别为空白对照组、几丁寡糖组、顺铂组和几丁寡糖联合顺铂组,先利用HE染色的方法镜下观察各组肿瘤组织的形态学变化,再应用免疫组织化学的方法,观察各组肿瘤组织中Ki67、P53及TTF-1的表达水平,通过对比各组药物对Ki67、P53及TTF-1表达水平的影响,分析其对裸鼠移植瘤的作用并探讨肿瘤的预后。结果:1.中药降解产物几丁寡糖具有抑制肺腺癌A549细胞增殖和迁移的作用,其效果随着浓度的增加而增大。几丁寡糖对肺腺癌A549细胞作用24h的IC50为6.840mg/mL,后续实验均以7mg/mL为浓度参数。2.几丁寡糖作用于A549细胞24h、48h、72h及96h后的增殖抑制率分别为49.80%、55.90%、71.30%和73.50%,顺铂对肺腺癌细胞的增殖抑制率分别为25%、47.4%、61.7%和71.2%,而两药联合对A549细胞的增殖抑制率分别为52.4%、73.7%、86.8%和87.4%。药物作用24h后,几丁寡糖联合顺铂组对肿瘤细胞的抑制率与几丁寡糖组相比,差异无统计学意义(P>0.05),但与顺铂组相比抑制率明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05);药物作用48h、72h和96h后几丁寡糖联合顺铂组对肿瘤细胞的抑制率与几丁寡糖组和顺铂组相比均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。几丁寡糖联合顺铂能够明显抑制肺腺癌A549细胞的增殖能力,其作用大于单独应用几丁寡糖或顺铂。3.细胞划痕实验结果显示,当几丁寡糖药物浓度为1mg/mL时,24h、48h相对划痕宽度分别为82.33%、42.68%,当几丁寡糖药物浓度为3mg/mL时,24h、48h相对划痕宽度分别为83.46%、60.52%,而空白对照组分别为:84.78%、21.79%,差异具有统计学意义(P<0.05)。几丁寡糖可以抑制肺腺癌A549细胞的迁移能力,且抑制作用随几丁寡糖药物浓度的增加而增大。当几丁寡糖药物浓度为7mg/mL时,24h、48h相对划痕宽度分别为81.79%、62.21%,当顺铂药物浓度为3μg/mL时,24h、48h相对划痕宽度分别为83.23%、55.91%,几丁寡糖和顺铂联合应用时,24h、48h相对划痕宽度分别为83.91%、69.67%,而空白对照组则分别为:84.11%、23.09%,各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。几丁寡糖联合顺铂组与几丁寡糖组及顺铂组相比,可以更加显著的降低肺腺癌A549细胞的迁移能力。4.Transwell小室迁移实验计算A549细胞的迁移数量,空白对照组578±26、几丁寡糖组462±21、顺铂组423±28、几丁寡糖联合顺铂组236±23,几丁寡糖联合顺铂组与顺铂组、几丁寡糖组和空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。几丁寡糖联合顺铂可以明显抑制肺腺癌A549细胞的迁移能力,其作用大于单独应用几丁寡糖或顺铂。5.细胞凋亡实验显示几丁寡糖组作用于肺腺癌A549细胞株24h后,早期凋亡率和晚期凋亡率分别为11.8%和5.3%(总凋亡率17.1%),顺铂组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为5.3%和4.5%(总凋亡率9.8%),几丁寡糖联合顺铂组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为6.7%和8.0%(总凋亡率14.7%),而空白对照组则分别为3.4%和2.8%(总凋亡率6.2%)。两药联合组与几丁寡糖组相比,差异无统计学意义(P>0.05),但分别与顺铂组和空白对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。中药降解产物几丁寡糖及与顺铂联合应用均能够诱导肺腺癌A549细胞凋亡。6.对裸鼠移植瘤组织进行HE染色镜下观察发现,空白对照组、几丁寡糖组及顺铂组肿瘤组织的形态学表现基本相同,即癌细胞呈弥漫性分布,且异型性明显,可见病理性核分裂像,肿瘤组织内部可见点状坏死;而几丁寡糖联合顺铂组镜下观察肿瘤组织,除了有上述表现以外,还可见局灶性坏死,并有细胞核破碎、固缩及染色质边集。7.对裸鼠移植瘤组织进行免疫组织化学染色结果显示,空白对照组、几丁寡糖组、顺铂组、几丁寡糖联合顺铂组各组之间Ki67免疫积分中位数分别为9、5、5、1,即Ki67的表达水平分别为强阳性(+++)、阳性(++)、阳性(++)和弱阳性(+),各用药组与空白对照组相比,表达量均显著降低,差异有统计学差异(P<0.05);其中,几丁寡糖联合顺铂组与其他两单药组及空白对照组相比,表达量降低更为显著,差异有统计学差异(P<0.05)。P53免疫积分中位数分别为2、1、1、1,即P53的表达水平均为弱阳性(+),各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。TTF-1免疫积分中位数分别为3、1、1、0,即TTF-1的表达水平分别为弱阳性(+)、弱阳性(+)、弱阳性(+)和阴性(-),联合用药组与空白对照组及两单药组之间比较差异有统计学意义(P<0.05),两单药组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。中药降解产物几丁寡糖联合顺铂能够明显下调裸鼠肺腺癌A549细胞移植瘤中Ki67、TTF-1的表达水平,其作用大于单独应用几丁寡糖或顺铂。结论:1.本研究从体外细胞学水平及体内动物模型上证明中药降解产物几丁寡糖联
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