废用对非冬眠和冬眠动物骨骼肌肌纤维Ca-(2+)浓度及Bax和Bcl-2的影响

废用对非冬眠和冬眠动物骨骼肌肌纤维Ca~(2+)浓度及Bax和Bcl-2的影响研究背景：现阶段对废用性肌肉萎缩的研究发现,骨骼肌萎缩的直接原因是蛋白质合成减少的同时其降解增多,其中以降解增多为主。本实验室的前期研究发现,骨骼肌在废用期会造成胞浆Ca2+超载,继而激活蛋白降解途径。同时也有研究发现,胞浆Ca2+超载与细胞的凋亡途径是密切相关的,其中Bax和Bcl-2分别是机体中重要的促凋亡基因和抑凋亡基因。研究目的：1.研究废用对大鼠和达乌尔黄鼠(Spermophilusdauricus)骨骼肌趾长伸肌(ExtensorDigitorumLongus,EDL)肌纤维中Ca2+浓度变化的影响,川芎嗪对后肢去负荷大鼠EDL胞浆钙的影响,并对比实验结果分析冬眠黄鼠在冬眠期不活动时肌肉不萎缩或较少萎缩的机制；2.研究废用时期的大鼠和黄鼠,动物体内骨骼肌中凋亡相关因子Box和Bcl-2在基因和蛋白质水平的相对表达量及其比值的变化情况,以期发现细胞凋亡与骨骼肌萎缩的关系,并从细胞凋亡的角度来分析黄鼠废用时抗肌萎缩的可能机制。研究方法：1.后肢去负荷大鼠动物模型的建立参考大鼠尾部悬吊法；2.用激光共聚焦法来测定活的EDL肌纤维中Ca2+的荧光强度,即活细胞中的相对Ca2+浓度；3.用实时定量PCR方法测定动物体内EDL和比目鱼肌(Soleus,SOL)中凋亡相关因子Box和Bcl-2在基因水平的相对表达量；4.用WesternBlot实验来测定动物体内EDL和SOL中凋亡相关因子Bax和Bcl-2在蛋白质水平的相对表达量。研究结果：1.大鼠在吊尾14d之后,其EDL肌纤维Ca2+浓度显著升高了68.6%(P<0.05)；与吊尾组相比,大鼠灌药组的EDL肌纤维中Ca2+浓度降低了46.2%(P<0.05)；2.与冬眠前组相比,黄鼠EDL肌纤维中Ca2+浓度在阵间激醒组升高了60.0%(P<0.05)；与冬眠中组相比,阵间激醒和出眠组分别升高了68.9%(P<0.05)和41.8%(P<0.05)；冬眠中组的Ca2+浓度与冬眠前黄鼠无差异；3.在基因表达水平,在骨骼肌(EDL和SOL)中,吊尾大鼠组的BaxlBcl-2比值相比较正常组来说分别升高了30.9%(P<0.05)和35.3%(P<0.05)；出眠组黄鼠的Bax/Bcl-2比值较冬眠前黄鼠分别下降了了28.3%(P<0.01)和17.7%(P<0.05)；4.在蛋白表达水平,在黄鼠骨骼肌(EDL和SOL)中,阵间激醒组中的Bax/Bcl-2比值较冬眠中组分别升高了82.5%(P<0.05)和26.9%(P<0.05),在SOL中,Bax/Bcl-2的比值在冬眠中组较冬眠前黄鼠降低了23.5%(P<0.05)。研究结论：1.大鼠在吊尾14天之后,其EDL肌纤维中Ca2+浓度显著升高,这会使钙蛋白酶Calpain转移到细胞膜上,进一步启动并降解骨骼肌中细胞骨架蛋白,最终启动并降解了蛋白质,引起了骨骼肌萎缩；川芎嗪灌药能显著降低EDL肌纤维中Ca2+浓度,可能是由于川芎嗪与细胞膜上的L-型Ca2+通道结合后抑制其开放,阻止了Ca2+进入胞浆从而缓解了钙超载现象,这可能是川芎嗪应对肌肉萎缩的机制。2.黄鼠骨骼肌肌纤维在冬眠中并未出现胞浆钙超载现象,这与黄鼠骨骼肌不发生萎缩或少量萎缩相一致。但阵间激醒组黄鼠的EDL中肌纤维胞浆Ca2+浓度较冬眠前和冬眠中都高,说明胞浆钙超载是一个有序的过程,当胞浆中Ca2+浓度超过机体调节的阈值时,会促使黄鼠主动应对这种不良的影响,即阵间激醒,出眠组与冬眠前组黄鼠并没有显著变化,说明黄鼠具有良好的调节能力,能更好的应对钙超载现象。3.基因水平：大鼠吊尾14天之后,骨骼肌(EDL和SOL)中Bax/Bcl-2的比值较正常组都有明显的升高,这也说明废用时大鼠骨骼肌发生了细胞凋亡现象,造成了肌萎缩。但灌药组又恢复了正常水平,说明了川芎嗪可以降低由细胞凋亡途径引起的肌肉萎缩；而黄鼠骨骼肌(EDL和SOL)中,出眠组Bax/Bcl-2的比值较冬眠前都有下降,说明出眠时黄鼠在基因水平的抑凋亡能力有所增强。4.在蛋白水平：黄鼠的骨骼肌(EDL和SOL)中,Bax/Bcl-2的比值在冬眠中不变或降低,这都说明了黄鼠可以抑制细胞凋亡的发生。而阵问激醒组较冬眠中都有升高,这说明在阵间激醒阶段黄鼠有