T-SHRH 012-2018 化妆品 眼刺激试验 体外重组类似人角膜上皮模型测试

71.100.70C2682Y42上海日用化学品行业协会团体标准T/SHRH

012-2018_________________________________________________________________________________________化妆品

眼刺激试验

体外重组类似人角膜上皮模型测试Cosmetics

Eye

test-

In

Cornea-like

前言…………… 21.范围………………………… 32.规范性引用文件…………… 33.基本原理…………………… 34

.仪器和试剂耗材…………… 35.试验方法…………………… 46.结果判定…………………… 6 本标准按照GB/T1.1-2009给出规则起草。本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。公司、上海日用化学品行业协会。向红、李琼、高宏旗、金坚、陈亦华

1 范围本标准规定了化妆品原料及成品眼刺激试验

体外重组类似人角膜上皮模型测试试验方法。本标准适用于化妆品原料及成品体外眼刺激性测试。本标准可作为眼刺激性动物试验的替代方法之一，可结合其他方法对眼刺激性进行综合评价。2 规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。OECD

Reconstructed

human

cornea-like

epithelium

(RhCE)

test

for

identifyingchemicals

not

requiring

classification

labelling

for

irritation

or

eye

3 基本原理涂布作用于三维重组类似人角膜上皮组织模型，一定时间暴露后经过清洗、孵育等步骤，通过MTT测试组织细胞生存率，从而判定受试物的刺激性。4 仪器和试剂耗材4.1 设备4.1.1 二氧化碳培养箱4.1.2 生物安全柜4.1.3 多功能酶标仪4.1.4 水浴锅4.1.5 计时器4.1.6 手术镊子4.2 试剂耗材4.2.1 重组类似人角膜上皮组织模型4.2.2 6

孔、12

96

孔细胞培养板4.2.3 DPBS

溶液4.2.4 MTT

4.2.5 乙酰甲酯4.2.6 去离子水4.2.7 无菌移液管5 试验方法5.1 模型接收与准备重组类似人角膜上皮模型经4℃低温运输至实验室。运输过程全程需保持无菌，避免破损。模型接3761.0mL。组织模型外包装用乙醇消毒，去除无菌纱布，将组织模型小孔取出，注意小孔底部是否有气泡，如有气泡则不可用。将组织小孔取出，注意去除凝胶，将其放入含培养基的6孔板中，底部不得有气泡。组织模型在375%1h1.0

mL测试培养基，在标准培养条件下孵育过夜（16-24h）。5.2 对照选取选择去离子水作为阴性对照，乙酸甲酯作为阳性对照。5.3 受试物准备5.3.1 测试物质37℃孵育15min，试物测试。5.3.2 受试物

MTT

反应测试一些受试物可能与对受试物与MTT50μ

L或固体50mg1mL

溶液的6孔板中，在标准培养条件下避光孵育约3h。阴性对照采用去离子水。如溶液出现变蓝或紫色，则受试物能够减少MTT，则需要加入死皮对照用于评价受试物是否导致的假MTT反应。5.3.3 有颜色或染色物质的测试对于有颜色物质或应用时变色的物质如其粘附在组织上并与一起提取，其可能干扰的测试，因此应考虑受试物的颜色属性。皮对照上测试。5.4 受试物测试确定受试物的测试浓度。5.4.1 液体受试物5.4.1.1 预处理组织模型孵育过夜后取出，每孔加入20μ

L

不含钙镁的DPBS缓冲液进行润湿，在标准培养条件（37℃,5%

CO2）孵育。5.4.1.2 受试物暴露每孔加入50μ

L30±2min对于难吸取液体可采用粘液移液器进行吸取加样。5.4.1.3 润洗用DPBS3100mL

DPBS在第一个烧杯中润洗2s32个和第35.4.1.4 浸泡将模型小孔放入含预热的测试培养基的12孔板中浸泡12±2min，去除模型中残留的受试物。5.4.1.5 孵育培养基的6120±15min。5.4.2 固体受试物5.4.2.1 预处理组织模型孵育过夜后取出，每孔加入20μ

L

不含钙镁的DPBS缓冲液进行润湿，在标准培养条件（37℃,5%

CO2）孵育。5.4.2.2 受试物暴露每个模型小孔加入50μ

L

DPBS50mg模型小孔中。应避免受试物加入到培养基中。在标准培养条件下孵育6h±。5.4.2.3 润洗受试物用DPBS润洗，具体步骤参照。5.4.2.4 浸泡将模型小孔放入含预热的测试培养基的12孔板中浸泡25±2min，去除模型中残留的受试物。5.4.2.5 孵育培养基的618±0.25h。5.5 MTT

5.5.1 取

300μL

1.0mg/mL

MTT

溶液加至

孔培养板，将测试后的模型小孔放至

孔板中，标准培养条件下孵育

±10min。5.5.2

2-8

温振荡

200L

至

96

570nm测定吸光度。5.5.3 对于固体受试物，将模型小孔放至含

1mL

异丙醇的

6

孔板中，将模型小孔不刺破放至含异丙醇的

6

200L

至

96

个重复，用酶标仪在

测定吸光度。

60.0%

NI5.6 死皮对照处理将未处理的模型测试小孔放置于-20-20℃保存。5.7 测试可接受标准测试结果成立必须满足以下条件：I

阴性对照OD值>0.8且II

阳性对照30min暴露及暴露其相对生存率均低于50%；III

相同受试物两个孔生存率的误差