酶组织化学总论

关于酶组织化学总论一.概述酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质高效性103-106倍专一性低反应条件易变性失活降低生化反应的反应活化能第2页,共33页，2024年2月25日，星期天酶活性的检测方法广义上说，任何一种可以测定反应物变化速度的分析技术，都可用来测定酶活性容量法（量气法）比色法与分光光度法荧光法与同位素法离子选择电极法，旋光法分子生物学，免疫化学法等第3页,共33页，2024年2月25日，星期天酶的组织化学

利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法第4页,共33页，2024年2月25日，星期天酶组织化学发展历史1868年Klebs组化1939年Takamatsu、Gomori碱性磷酸酶1940-1960年电镜酶组织化学1955年Scheldon酸性磷酸酶免疫酶组织化学1970年Sternberger酶标抗体法目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达100余种第5页,共33页，2024年2月25日，星期天酶的种类1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂解酶5.异构酶6.合成酶第6页,共33页，2024年2月25日，星期天二.酶组织化学反应的基本知识酶的特性酶的定位酶组织化学的基本原理第7页,共33页，2024年2月25日，星期天（一）酶的特性水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂有机溶剂不同程度降低酶的活性易受温度影响，对热耐受性弱对干燥耐受性强第8页,共33页，2024年2月25日，星期天（二）酶的定位酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位5‘-核苷酸酶——浆膜

ATPase——肌球蛋白细胞膜线粒体第9页,共33页，2024年2月25日，星期天(三）酶组化的基本条件同时保存结构和酶的活性保存酶的定位，防止酶的扩散或移位保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：温度PH值抑制剂激活剂第10页,共33页，2024年2月25日，星期天（四）原理及一般原则第11页,共33页，2024年2月25日，星期天1.基本原理

细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物）然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在第12页,共33页，2024年2月25日，星期天第一反应：酶促反应

底物初级反应产物（PRP）第二反应：捕捉反应

PRP+捕捉剂终反应产物（FRP）酶第13页,共33页，2024年2月25日，星期天*PRP弥散：1.底物在酶催化下水解的速度2.PRP在缓冲液中的弥散系数3.PRP与辅助物反应的速度应选择合适的底物和辅助物,减少弥散捕捉剂的浓度（<1mg/ml）第14页,共33页，2024年2月25日，星期天2.一般原则对组织处理,制片过程不能影响酶的活性及分布所选底物和辅助物必须迅速,同步穿透入组织和细胞中所选底物最好只能被一种酶催化分解所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响其他反应试剂的穿透性PRP必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶性的有色稳定产物所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合第15页,共33页，2024年2月25日，星期天(五)酶组织化学的主要步骤1.酶的固定（fixation）2.酶的特异性反应（specificreaction）3.在最适条件下,酶反应产物的沉着（precipitation）4.使沉着物具有可见性（visualization）组织/细胞制作切片酶反应（孵育）显色封片镜检第16页,共33页，2024年2月25日，星期天（六）各步骤注意问题检测方法的选择酶的保存与固定

一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片-70℃长期保存固定剂1-4%多聚甲醛,福尔马林,戊二醛固定时间固定方法:浸泡固定灌流固定固定温度:0—4℃第17页,共33页，2024年2月25日，星期天（六）各步骤注意问题3.切片制作:切片厚度<40um4.缓冲液选择缓冲液用于A.配置固定液

B.漂洗液

C.配置酶反应孵育液选择缓冲液应注意

A.不能减弱目标酶的活性B.不能含有与捕捉机制相同的物质

C.注意漂洗用缓冲液的渗透压

D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同第18页,共33页，2024年2月25日，星期天（六）各步骤注意问题5.孵育反应A.孵育液配置

B.孵育的温度和时间:37℃15-30minC.切片孵育法-切片孵育-漂浮孵育第19页,共33页，2024年2月25日，星期天（六）各步骤注意问题6.酶特异性对照实验用酶活性抑制剂采用无底物的孵育液过固定或加热用针对目标酶的激活剂改变孵育液底物选择最适PH酶细胞内的定位差异第20页,共33页，2024年2月25日，星期天（六）各步骤注意问题7.孵育后操作光镜:

酶孵育后进行后固定脱水封片,镜检电镜:

孵育后,后固定脱水超薄切片后染色电镜检查第21页,共33页，2024年2月25日，星期天（六）各步骤注意问题8.人为产物及其原因酶或与检测有关物质的扩散最终反应产物的扩散吸附现象反应阴性第22页,共33页，2024年2月25日，星期天三.显示酶的组织化学方法（一）金属离子沉淀法一般用于显示磷酸酶第23页,共33页，2024年2月25日，星期天1.钙钴法β-甘油磷酸钠磷酸酯+Ca++磷酸钙

磷酸钴硫化钴（黑色沉淀）

酶底物PRP（磷酸）+某金属金属显色与底物混合液中置换某金属离子结合AKPCo++硝酸钴硫化胺酶第24页,共33页，2024年2月25日，星期天2.Gomori硝酸铅法β-甘油磷酸钠磷酸酯+铅磷酸铅

硫化铅（黑色沉淀）酶底物PRP（磷酸）显色反应与底物混合液中金属离子结合ACP硫化胺酶直接沉着第25页,共33页，2024年2月25日，星期天

（二）偶氮偶联法（偶氮色素法）1.原理底物混合液PRP与不溶性重氮盐结合偶氮色素2.方法同时偶联法后偶联法酶偶氮偶联第26页,共33页，2024年2月25日，星期天3.常用底物萘酚AS-BI萘酚AS-D

萘酚AS-MX萘酚AS-TR

常用重氮盐坚牢兰RR坚牢兰B坚牢红RC

坚牢红TR坚牢紫B

六偶氮副品红六偶氮新品红第27页,共33页，2024年2月25日，星期天4.举例

α-萘基磷酸钠磷酸氢二钠+α-萘酚

α-萘酚+坚牢兰偶氮染料沉淀5.应用可显示ALPase,ACPase,酯酶,转肽酶,肽酶,β-葡糖苷酶等磷酸酶第28页,共33页，2024年2月25日，星期天(三)联苯胺色素法用于显示过氧化物酶原理:

无色联苯胺有色联苯胺过氧化物酶,H2O2脱氢

(DAB)联苯胺褐第29页,共33页，2024年2月25日，星期天(四)四唑盐法用于显示氧化酶和脱氢酶原理:四唑盐或双四唑盐氢离子与与底物混合液无色四唑盐结合红色或兰色的沉淀

脱氢酶+2H被还原第30页,共33页，2024年2月25日，星期天常用四唑盐种类三苯四唑氯化物TTC

蓝四唑盐BT

新四唑盐NT

四唑氮蓝NBT

四氮四唑盐氯化物TNBT第31页,共33页，2024年2月25日，星期天(五)靛蓝反应原理:底物被酶