【课件】紫外分光光度法

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(UltravioletandVisibleSpectrophotometry,UV-Vis)紫外-可见吸收光谱吸收光谱的测量-----Lambert-Beer

定律紫外-可见分光光度计仪器组成分析条件选择UV-Vis分光光度法的应用紫外-可见分光光度计的维护和保养UV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的吸收特性。UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在160~780nm.UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光谱(UV)为四大波谱之一，是鉴定许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。紫外-可见吸收光谱电磁波谱g-X-射线紫外可见红外微波无线电2004008003200(nm)波长真空紫外近红外核磁共振波长越短，能量越高基态

E0激发态

E1DE=E1-E0=hn能量激发e能量差DE一、分子吸收光谱的形成过程：运动的分子外层电子--------吸收外来外来辐射------产生电子能级跃迁-----分子吸收谱能级组成：除了电子能级(Electronenergylevel)外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动(Vibration)能级和转动(Rotation)能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振-转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化

E为各种形式能量变化的总和：其中

Ee最大：1-10eV;

Ev次之：0.05-1eV;

Er最小：

0.05eV能量振动跃迁转动跃迁v1v1v0543110电子跃迁E1E0v0v1v1可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大1~100个数量级，在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成带状光谱。

二、分子吸收光谱跃迁类型各轨道能级高低顺序：

n

*

*；可能的跃迁类型：

-

*；-

*；-

*；n-*；-

*；n-*

-

*：C-H共价键，如CH4（115nm）；C-C键，如C2H6(135nm)，处于真空紫外区；

-

*:和

-

*跃迁：尽管所需能量比上述

-

*跃迁能量小，但波长仍处于真空紫外区；n-*：含有孤对电子的分子，如H1O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl(173nm);CH3I(158nm)；(CH3)1S(119nm)；(CH3)1O(184nm)CH3NH1(115nm)；(CH3)3N(117nm)，可见，大多数波长仍小于200nm，处于近紫外区。以上四种跃迁都与成键和反键轨道有关（

-

*，-

*，-

*和n-*），跃迁能量较高，这些跃迁所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因而在此不加讨论。只有

-

*和n-*两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。几个概念：生色团（Chromogenesisgroup）：分子中含有非键或

键的电子体系，能吸收外来辐射时并引起n-*

和

-

*跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。助色团（Auxochromousgroup）：含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。红移或蓝移（Redshiftorblueshift）：在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰向长波方向（红移）或短波方向移动（蓝移）的现象。吸收光谱的测量

Lambert-Beer

定律入射光I0透射光I光程长b透射率

T%=II0×100%一、透射率T%

当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比，即k为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。

当浓度以g/L表示时，称k为吸光系数，以a表示，即

当浓度以mol/L表示时，称k为摩尔吸光系数，以

表示，即

比a更常用。

越大，表示方法的灵敏度越高。

与波长有关，因此，

常以

表示。二、Lambert-Beer

定律三、偏离Lambert-Beer定律的因素样品吸光度A与光程b总是成正比。但当b一定时，A与c并不总是成正比，即偏离Lambert-Beer定律！这种偏离由样品性质和仪器决定。样品性质影响待测物高浓度—吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收能力发生变化—

变化；试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。

仪器因素仪器因素包括光源稳定性以及入射光的单色性等。入射光的非单色性：不同光对所产生的吸收不同，可导致测定偏差。谱带宽度与狭缝宽度：“单色光”仅是理想情况，经分光元件色散所得的“单色光”实际上是有一定波长范围的光谱带(即谱带宽度)。单色光的“纯度”与狭缝宽度有关，狭缝越窄，它所包含的波长范围越小，单色性越好。紫外-可见光度计仪器组成UV示意图光源单色器样品池检测器紫外-可见光度计仪器组成光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。碘钨灯：300~3300nm，多用在可见及近红外光谱；氘灯：160~400nm，多用在紫外区。单色器(Monochromator)与原子吸收光度仪不同，在UV-Vis光度计中，单色器通常置于吸收池的前面！（可防止强光照射引起吸收池中一些物质的分解）样品室(Cell，Container)：用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。检测器：硅光电池、PMT、PDAUV2550光路图UV2450光路图UV3600光路图分析条件选择由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。由L-B定律：

微分后得：

将上两式相比，并将dT和dc分别换为

T和

c，得：当相对误差

c/c最小时，求得T=0.368或A=0.434。即当A=0.434时，吸光度读数误差最小！通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在0.15~1.00范围内。

一、仪器测量条件二、反应条件选择(显色法)显色剂的选择原则：使配合物吸收系数

最大、选择性好、组成恒定、配合物稳定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大等。显色剂用量：配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格控制。溶液酸度：配位数和水解等与pH有关。显色时间、温度、放置时间等。测定波长的选择三、参比液选择溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）；试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。四、干扰消除控制酸度：

配合物稳定性与pH有关，可以通过控制酸度提高反应选择性，副反应减少，而主反应进行完全。如在0.5MH2SO4介质中，双硫腙与Hg2+生成稳定有色配合物，而与Pb2+、Cu2+、Ni3+、Cd2+等离子生成的有色物不稳定。选择掩蔽剂合适测量波长干扰物分离导数光谱及双波长技术UV-Vis分光光度法的应用一、定性分析不同物质结构不同或者说其分子能级的能量(各种能级能量总和)或能量间隔各异，因此不同物质将选择性地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是UV-Vis定性分析的基础。定性分析具体做法是让不同波长的光通过待测物，经待测物吸收后，测量其对不同波长光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A为纵坐标，辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸收光谱或吸收曲线，据吸收曲线的特性(峰强度、位置及数目等)研究分子结构。

-胡罗卜素咖啡因阿斯匹林丙酮几种化合物的分子吸收光谱图Woodward-Fieser规则制作试样的吸收曲线并与标准紫外光谱对照；利用Woodward-Fieser和Scott经验规则求最大吸收波长。

即，当通过其它方法获得一系列可能的分子结构式后，可通过此类规则估算最大吸收波长并与实测值对比。Woodward-Fieser规则估算实例：二、定量分析单组份定量方法标准曲线法（略）标准对比法：该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为cs的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由Ax=kcx求出cx该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且cx与cs大致相当时，才可得到准确结果。多组分定量方法由于吸光度具有加合性，故可在同一试样中测定多个组份。设试样中有两组份X和Y，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：

图a)：X,Y组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。

图b)和c)：X,Y相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X和Y的浓度：

其中，X,Y组份在波长

1和

2处的摩尔吸光系数

可由已知浓度的X,Y纯溶液测得。解上述方程组可求得cx及cy。

双波长法—等吸收点法当混合物的吸收曲线重迭时，如右下图所示，可用双波长法来测定。

具体做法：将a视为干扰组份，现要测定b

组份

a)

分别绘制各自的吸收曲线；

b)

画一平行于横轴的直线分别交于a组份曲线两点，并与b组分相交；

c)

以交于a上一点所对应的波长

2（259.7nm）为参比波长，另一点对应的为测量波长

1（289nm），并对混合液进行测量，得到：

A1=A1a+A1b+A1s

A2=A2a+A2b+A2s

若两波长处的背景吸收相同，即A1s=A2s

二式相减，得：

A=(A1a-A2a)+(A1b-A2b)

由于a组份在两波长处的吸光度相等，

因此：

A=(A1b-A2b)=(1b-2b)lcb

从中可求出cb.同理，可求出ca.盐酸普卡因含量测定导数光谱法定义：将吸光度信号转化为对波长的导数信号的方法。导数光谱是解决干扰物质与被子测物光谱重叠，消除胶体等散射影响和背景吸收，提高光谱分辨率的一种数据处理技术。原理：

已知，对波长求一阶导数，得

可见，一阶导数信号与浓度成正比。

同样可得到二阶、三阶….n阶导数信号亦与浓度成正比。三、积分球及其应用透射、反射测定；分析混浊、不透明、固体样品。混浊、不透明样品中的散射表面粗糙样品的漫反射固体样品厚度对焦点位置的影响SDS:镜反射D:漫反射光原理样品样品参比光束标准白板标准白板样品光束实例：宇航服布料的抗紫外测定布料在紫外可见近红外波段的透过与反射曲线部分其他使用积分球的测定例：《使用积分球测定样品的镜反射和漫反射光谱》《紫外分光光度计和积分球测定镜头类样品的透过率》《紫外可见分光光度计测定色度鉴定书画真伪》《紫外可见分光光度计和积分球附件测定太阳能镀膜材料的透射率、反射率和雾度》《紫外可见分光光度计测定纺织品的紫外防护系数》《岛津UV3600测定平板型太阳能集热器的太阳吸收比及透射比》注：选自岛津公司应用数据集相对镜反射测定分析表面光滑样品四、5度入射角镜反射附件及其应用原理θθ标准镜样品入射光检测器GB/T2680-94建筑玻璃、可见光透射比、太阳光直接透射比、太阳能总透射比、紫外线透射比及有关窗玻璃参数的测定标准要求测定光谱反射比时，配镜面反射装置计算太阳能总透射比，遮蔽系数需要用到太阳光直接反射比实例：建筑玻璃参数测定部分其他使用5度入射角镜反射附件的测定例：《镜反射附件和日射透射率测定软件测定汽车玻璃贴膜》注：选自岛津公司应用数据集五、绝对反射附件及其应用绝对镜反射测定分析表面光滑样品原理入射光测定光路反射光测定光路样品M2M2’M3M3’M1检测器入射光入射角和偏振偏光器473nm的反射率几乎

0%

充分透射473nm光实例：输出反射镜侧

AR膜输出镜谐振腔激光激发光LD（激光二极管）六、其他附件具塞比色皿不同光程长比色皿半微量比色皿微量比色皿6联池架在样品一侧最多可安放6个10mm方形池微量池带光阑池架8/16联微量多联池架常温/恒温(10~60℃)可选恒温池架5~90℃恒温4联池架5~90℃NTTP2200恒温水循环装置5~80℃电子冷热式恒温池架7~60℃无需恒温水槽和冷却循环水6联电子冷热式池定位装置16~60℃无需恒温水槽和冷却循环水电子冷热式单池架S17000~110℃升/降温程序控制需要冷却水半自动进样器组件蠕动泵方式可搭配标准型、3次通过型、恒温型，超微量型流通池半自动注射进样器注射泵方式常/恒温可选自动样品转换器ASC5与半自动进样器组合，构成多溶液样品测定系统5/10mm微量流通池连续测定诸如色谱柱洗脱液液相色谱用流通池可作高效液相色谱仪的UV/Vis检测器十字形流通池监控场合光程1~15mm可调七、选配软件色彩测定软件计算色彩值膜厚计算软件 计算薄膜膜厚日射透射率/反射率软件 日射透射率/反射率计算紫外-可见分光光度计的维护与保养一、环境要求使用工作温度：15～35℃，湿度：45～80%，如果温度高于30℃，则湿度必须小于70%避免日光直射避免震动避免强磁场，电场远离腐蚀性气体，并避免置于任何可能导致紫外区吸收的含有机/无机试剂气体的区域避免脏污、多尘环境二、工作台要求可承受压力35Kg+25Kg（PC）最小尺寸：长：1120mm，宽：710mm，高：520mm三、电源要求供电电压：100/120/220/230/240V交流±5%50/60Hz功率消耗：约190VA保险丝使用：100-120V供电，5A；220-240V供电，3.15A安装地点具备可靠的仪器接地端子D2灯WI灯四、光源更换操作时,必须等待至光源冷却,约20分钟光源性能WI灯更换时，带上干净手套，先板开碘钨灯的弹簧架，再按图示方向旋转弹簧片，以便WI退出。安装时相反。安装时避免WI灯窗口污染。D2灯更换时，带上干净手套，拔出旧灯，把握新灯窗口背部，将新灯插入灯插座。安装时避免D2灯窗口污染。保险丝座保险丝电源转换器五、保险丝更换关闭电源，拔离仪器电源线。如图，用螺丝批拨开保险丝座外盖，取出保险丝座。更换不良保险丝，注意使用适当规格保险丝（3.15A适用于230V）。更换后，推回保险丝座，注意箭