【课件】高效液相色谱法

高效液相色谱法一、色谱法概述色谱法是一种分离技术色谱法原理

是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，使各组份在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。两相中有一相是固定的，叫作固定相，有一相是流动的，成为流动相。高效液相色谱是以液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同分为：液液分配色谱；液固吸附色谱；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。

此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。高效液相色谱与气相色谱比较气相色谱高效液相色谱只能分析挥发性物质，只能分析20%的化合物几乎可以分析各种物质不能分析热不稳定物质可以分析热不稳定物质用毛细管色谱可得到很高的柱效色谱柱不能很长，柱效不会很高有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器(FID和TCD)没有较高灵敏的通用检测器流动相为气体，无毒，易于处理流动相有毒，费用较高运行和操作容易运行和操作比GC难一些仪器制造难度较小仪器制造难度大液相色谱仪结构流程HPLC仪器结构图注射器进样器高压泵混合室溶剂预柱接头色谱柱检测器数据系统高效液相色谱分析过程

分析前，选择适当的色谱柱和流动相。开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大输入计算机，经过工作站数据处理，就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。二、主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150×105～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10μm)，液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳，脉冲小，流量稳定可调，耐腐蚀等特性。(2)进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，

结构如图所示：(3)高效分离柱柱体为直形不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(4)检测器

a.紫外-可见光检测器⑴检测原理：基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。液相色谱仪一般都配置有UV-Vis检测器⑵组成：光源、流通池、检测元件、工作站等。⑶特点：①灵敏度高，噪声低；②不破坏样品，可用于制备；③对温度、流动相流速波动不敏感，可用于梯度淋洗；④属于浓度型检测器。⑷缺点①只能检测有紫外吸收的样品；②检测波长＞流动相的截止波长。⑸波长选择①选择λmax作检测波长，以得到较高的灵敏度；②检测波长＞流动相的截止波长。⑹紫外检测器的类型①固定波长型(已淘汰)；②可变波长型(最常用)；③二极管阵列检测器(最新型)。b.光电二极管阵列检测器

紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。二极管阵列检测器(diode-arraydetector,DAD)以光电二极管阵列作为检测元件的紫外检测器它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。DAD与UV检测器的区别普通UV检测器是先用单色器分光，然后让特定波长的光进入流通池。DAD检测器是先让所有波长的光都通过流通池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。c.示差折光检测器

（Differentialrefractiveindexdetector）

除紫外检测器之外应用最多的检测器。可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度成正比。

通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）。灵敏度低，对温度敏感，不能用于梯度洗脱。

d.荧光检测器

（Fluorescencedetector）许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。对多环芳烃，维生素B，黄曲霉素，卟啉类化合物，农药，药物，氨基酸，甾类化合物等有响应。5）电导检测器电导检测器主要用于离子色谱的检测。其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH>7时，该检测器不够灵敏。

HPLC流动相和固定相简介一、流动相与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。理想的溶剂应有下列特性：1）对待测物具一定极性和选择性；2）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时使截止波长增加；4）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。溶剂的脱气处理脱气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动脱气方法1.超声波脱气法2.抽滤脱气法3.He脱气法1.正相洗脱用极性小于固定相的流动相的洗脱方式，称为正相洗脱、正相展开。适用于正相色谱法。例如，水、正己烷、正戊烷的值分别为10.2、0.1、0.0，作正相洗脱时，水洗脱能力最强，正己烷和正戊烷的洗脱能力最弱。流动相(溶剂系统)>>

正相洗脱与反相洗脱1.等度洗脱(isocraticelution)用恒定配比的溶剂系统的洗脱方式，称为等度洗脱优点：简便、重复性好、色谱柱易再生。缺点：对于成分复杂的样品，效果欠佳。2.梯度洗脱(gradientelution)梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值、离子强度相应地变化，达到提高分离效果、缩短分析时间的目的。流动相(溶剂系统)>>

洗脱方式

流动相(溶剂系统)>>

洗脱方式梯度洗脱的实质：是通过不断地变化流动相的浓度配比，来调整混合样品中各组分的K值，使所有谱带都以最佳平均K值通过色谱柱。比较梯度洗脱与程序升温：在梯度洗脱中溶质K值的变化是通过溶剂的极性、pH值和离子强度来实现的，用于分离组分性质差别较大的复杂样品；而程序升温是借改变温度来影响溶质的K值，用于分离宽沸程的混合样品。优点：①缩短分析周期；②提高分离效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加检测灵敏度。等度洗脱与梯度洗脱1.按承受压力分刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.0×108~1.0×109Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱；硬胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为

3.5×108Pa,主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。二、固定相载体由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。2.按孔隙深度分表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、柱效高。特别适于复杂混合物的分离。2、色谱基本参数与流出曲线的表征1.基线

无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.保留值

（1）时间表示的保留值保留时间(tR)：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；（动画）

死时间(tM)：不与固定相作用的气体(如空气)的保留时间；调整保留时间（tR

＇）：tR＇=

tR－tM

（2）用体积表示的保留值

保留体积（VR）：

VR=tR×qvqv为柱出口处的载气流量，单位：mL/min。

死体积（VM）：

VM=

tM×qv

调整保留体积(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

3.相对保留值r21

组分2与组分1调整保留值之比：

r21=t´R2

/t´R1=V´R2/V´R1

相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。4.区域宽度

衡量色谱峰宽度的参数，三种表示方法：（1）标准偏差(

)：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354

。（3）峰底宽(Wb)：Wb=4

。2.相平衡参数

（1）分配系数（partitioncoefficient）

K

组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：分配系数是色谱分离的依据。分配系数K的讨论

一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。3.分配比（partitionradio）k一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。

1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。

2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。

3.分配比可以由实验测得。

分配比也称：容量因子(capacityfactor)和容量比(capacityradio)；4.容量因子与分配系数的关系

式中β为相比。填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留时间越长。

VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；

VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同；

气-液色谱柱：VS为固定液体积；

气-固色谱柱：VS为吸附剂表面容量。5.分配比与保留时间的关系

滞留因子（retardationfactor）：us：组分在分离柱内的线速率；u：流动相在分离柱内的线速度；滞留因子RS也可以用质量分数w表示：

若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为tR和tM，则tR=tM(1+k)通过上式可直接由实验获得的保留值求出分配比。6.分离因子

分离因子（也称为选择性因子）也可用来衡量两物质的分离程度，用α表示。

7.色谱流出曲线的数学描述

色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线上的浓度与时间的关系为

当色谱峰为非正态分布时，可按正态分布函数加指数衰减函数构建关系式。色谱理论需要解决的问题？色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论。

塔板理论的假设：

(1)每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；

(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；

(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；

(4)每次分配的分配系数相同。3.2.2

塔板理论-柱分离效能指标

1.塔板理论（platetheory）

半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复。

色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!理论塔板数与色谱参数之间的关系为

n=L/H色谱峰的方差

与柱长或保留时间的关系为：

2.有效塔板数和有效塔板高度

单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：3.塔板理论的特点和不足

(1)当L一定时，n

越大(H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的K不同，用n有效和H有效作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。

(3)柱效的高低不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。

(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。3.2.3

速率理论-影响柱效的因素1.速率方程（也称范·弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度，

u：载气的线速率(cm/s)。

减小A、B、C三项可提高柱效。存在着最佳流速。

A，B，C三项各与哪些因素有关？A─涡流扩散项

A=2λdpdp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。B/u—分子扩散项

B=2υDg

υ：弯曲因子，填充柱色谱，υ<1。

Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）

(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;(3)B/u与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(4)扩散系数：Dg

∝(M载气)-1/2，M载气↑，B值↓。

k为容量因子；Dg

、DL为扩散系数。减小担体粒度，选择相对分子质量小的气体作载气，可降低传质阻力。C·u—传质阻力项传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL，即

C=（Cg+CL）（动画）2.载气流速与柱效——最佳流速载气流速高时：

传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速

，柱效

。载气流速低时：

分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速

,柱效

。H-u曲线与最佳流速：

由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。3.速率理论的要点

(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散、传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。

(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。

(3)为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。

(4)各种因素相互制约：载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提