牛结核病诊断技术（γ-干扰素体外ELISA法）

1牛结核病诊断技术(γ-干扰素体外ELISA法）本文件规定了牛结核病诊断技术(γ-干扰素体外ELISA法）的试剂及仪器、检测方法、质量控制和结果判定等。本文件适用于牛结核病诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18645动物结核病诊断技术GB19489实验室生物安全通用要求GB/T32945牛结核病诊断体外检测γ干扰素法3术语和定义本文件没有特别需要界定的术语和定义。4原理感染牛分枝杆菌的牛，其T淋巴细胞已被牛分枝杆菌致敏并产生免疫记忆。当体外再次遇到牛分枝杆菌特异性抗原（结核菌素）刺激时，牛外周血中淋巴细胞被激活并大量释放γ-干扰素，而未被感染的牛则不会分泌或低水平分泌γ-干扰素。通过双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测特异性γ-干扰素浓度水平，即可诊断牛结核病。5试剂及仪器外周抗凝血培养所需材料参见附录A。夹心ELISA所需试剂和材料参见附录B。5.2仪器检测所需仪器参见附录C。26检测方法6.1试剂配制检测所需试剂的配制见附录D。6.2样品采集与处理6.2.1无菌采集牛尾静脉血3mL～4mL，加入至含肝素锂或肝素钠的抗凝血真空管中，轻轻颠倒2次~3次使血液和抗凝剂混合均匀。室温（22±5℃)运送至实验室并在采血后24h内进行培养。6.2.2分装前轻轻颠倒抗凝血真空管，充分混匀血液样品。将抗凝血无菌加入至48孔细胞培养板，每头牛抗凝血分装3孔，1.0mL/孔（可参考表1）。6.2.3在每头牛的3孔抗凝血样品中，分别无菌加入67μLPBS、67μL禽型PPD溶液和67μL牛型PPD溶液（可参考表1），用微量振荡器低速充分振荡，使刺激抗原与抗凝血完全混合。6.2.4盖上细胞培养板盖，避免液体挥发。将含有抗凝血和刺激抗原的48孔细胞培养板在37℃湿温培养箱中孵育16h～24h。6.2.5使用移液器小心吸取上层血浆200μL～300μL，转至1.5mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入红细胞。表1.抗凝血样品和刺激原加入到48孔细胞培养板（竖排放置）6.3酶联免疫吸附试验6.3.1溶解阳性、阴性对照冻干粉，配制1×PBST洗涤液，按“操作注意事项”平衡其他试剂。6.3.2取商品化已包被有γ-干扰素单克隆抗体的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用先加入50μL样品稀释液至各孔中，再加入50μL血浆样品及阳性对照、阴性对照至各孔中，轻轻振匀孔中样品，贴上封板膜，37℃孵育2h。6.3.3弃去孔内液体。使用1×PBST洗涤液洗板5次，300μL/孔。每次静置1min后弃洗涤液，洗涤完毕后在吸水纸上拍干。36.3.4用酶标抗体稀释液按1：100稀释酶标抗体（现配现用）。在每孔中加入100μL新鲜配制的酶标抗体，贴上封板膜，37℃孵育2h。6.3.5使用1×PBST洗涤液洗板5次，300μL/孔。每次静置1min后弃洗涤液，洗涤完毕后在吸水纸上拍干。6.3.6每孔加入100µL底物显色液，贴上封板膜，37℃避光显色10min。6.3.7按照加入底物显色液的顺序和时间间隔每孔加入50µL终止液，15min内在酶标仪上测定OD450nm。6.4操作注意事项6.4.1由于本试验需要活的淋巴细胞，因此需要使细胞损伤降至最低。任何情况下不应将抗凝血贮存于冰箱中。6.4.2刺激后的血浆样品如不直接进行酶联免疫吸附试验，血浆可在2℃~8℃贮存7天，在-20℃可贮存6个月。贮存前，每个贮存管必须用合适的盖子密封。应在样品架上标记日期、操作者的首字母、管内容物、动物编号和牛群细节等相关信息。检测前，样品应恢复至室温并充分混匀。6.4.3除酶标抗体外，试剂盒使用前各组份应平衡至室温，使用后即放回2℃~8℃。6.4.4不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用过程中各试剂组份应避免交叉污染。6.4.5底物显色液避免暴露于强光和接触氧化剂。6.4.6终止液中含有H2SO4，使用时注意不要接触到身体和衣物。6.4.7抗体包被酶标板拆封后应避免受潮或沾水（每次将剩余的抗体包被酶标板用封口袋扎紧后尽快置于2℃~8℃)。6.4.8阳性对照和阴性对照冻干粉用灭菌纯水稀释并使用后，尽快置于2℃~8℃保存。6.4.9待检血浆样品数量较多时，可先使用样品稀释液稀释完所有待检血浆，再将稀释好的血浆转移到反应板，保证反应时间一致。6.4.10严格按照操作说明书要求进行，操作过程中移液、定时和洗涤等过程应精确。7质量控制在判定结果前必须检查对照样品的结果，确定阴性对照和阳性对照的OD450nm值在规定范围之内：阴性对照OD450nm值范围为0.0~0.15。阳性对照OD450nm值范围为0.7~3.0。如果有一条标准不符合，试验是无效的，应重新进行检测。8结果判定8.1计算每个样品PBS刺激组、禽型PPD刺激组和牛型PPD刺激组的OD450nm值。如果做重复孔，应计算每头牛所有样品PBS刺激组、禽型PPD刺激组和牛型PPD刺激组的平均OD450nm值。8.2结果判定标准阳性判定标准：牛型PPD刺激组OD450nm值-PBS刺激组OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激组OD450nm值-禽型PPD刺激组OD450nm值≥0.1。阴性判定标准：牛型PPD刺激组OD450nm值-PBS刺激组OD450nm值＜0.1，或牛型PPD刺激组OD450nm值-PBS刺激组OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激组OD450nm值-禽型PPD刺激组OD450nm值＜0.1。9安全措施按照GB/T18645和GB19489执行。（资料性）外周抗凝血培养所需材料A.1肝素锂或肝素钠真空抗凝管；A.25mL或10mL动物采血器；A.3无菌48孔细胞培养板；A.4牛型PPD溶液（2.5mL/瓶）；A.5禽型PPD溶液（2.5mL/瓶）；A.6100µL、1000µL枪头；A.7用于贮存血浆的1.5mL离心管；A.896孔板架。（资料性）夹心ELISA所需试剂和材料B.1酶标板（包被牛γ-干扰素单克隆抗体，含0.1%ProClin300）；B.2牛γ-干扰素阳性对照冻干粉（含0.1%ProClin300）；B.3牛γ-干扰素阴性对照冻干粉（含0.1%ProClin300）；B.4样品稀释液（血浆稀释缓冲液，含0.1%ProClin300）；B.5PBST洗涤液（20×)（含0.1%ProClin300）；B.6酶标抗体（含0.1%ProClin300）；B.7酶标抗体稀释液（含0.01%的硫柳汞）；B.8底物显色液（TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）溶液）；B.9终止液（0.5MH2SO4B.10灭菌纯水（用于溶解阳性对照、阴性对照冻干粉）；B.11蒸馏水（用于稀释洗液）；B.12酶联免疫吸附试验所需的试剂、反应槽、封板膜和枪头。（资料性）检测所需仪器C.137℃湿温培养箱；C.2精密可调移液器（100µL、1000µL）；C.31mL、5mL、10mL的移液器；C.4100mL、1L、2L的量筒；C.512道移液器（50µL～300µL）；C.6微量振荡器（可选）；C.7洗板机（可选）；C.837℃水浴锅；C.9酶标仪（含450nm滤光片）。8（规范性）检测所用试剂的配制D.1刺激抗原牛型PPD溶液（10000IU/mL）和禽型PPD溶液（7500IU/mL）在使用前彻底混匀，2.5mL/瓶。D.2酶标板在开封前将酶标板恢复至室温，可放置30min以上。D.3阳性对照和阴性对照用0.2mL灭菌纯水分别溶解阴、阳性对照冻干粉。应保证完全溶解，溶解的阳性对照、阴性对照在2℃~8℃可储存1个月，但再次使用前应恢复至室温并充分混匀。D.4样品稀释液恢复至室温并充分混匀，用作血浆稀释缓冲液。D.5酶标抗体和酶标抗体稀释液酶标抗体必须一直保存于2℃~8℃。酶标抗体稀释液可直接使用。按表2配制酶标抗体工作液，现配现用，未用完的试