高效液相色谱法及其在中药分析中的应用

关于高效液相色谱法及其在中药分析中的应用26.03.2024126.03.20242慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液第2页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.20243按溶质在分离过程中的原理：吸附色谱分配色谱离子交换色谱体积排阻色谱亲和色谱液相色谱的分类第3页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.20244按色谱固定相的形式：平板色谱（平面色谱）柱色谱按分离的压力高压液相色谱（高效液相色谱）中压液相色谱常压液相色谱液相色谱的分类第4页,共74页，2024年2月25日，星期天H－dp关系图第5页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.20246一般也把吸附色谱法称为液固色谱法。液固色谱法的固定相一般为固体吸附剂，常用的是：碳酸钙、硅胶、氧化铝、氧化镁、活性炭等。其中硅胶最为常用。吸附色谱对中等分子量的油溶性样品可获得最佳的分离，而对强极性或离子型的样品，有时会发生不可逆吸附，不能得到满意的结果。液固色谱法第6页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.20247吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表明存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的活性中心上进行竞争，同时不同溶质之间和同一溶质的不同官能团之间液也存在竞争。竞争的综合结果就是形成不同溶质在吸附剂表面吸附、解吸平衡。基本原理：第7页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.20248吸附解吸X表示溶质分子，下标m为流动相，s为固定相M表示流动相分子，下标m为流动相，s为固定相n为被溶质分子取代的流动相分子数目用一个式子表示如下：第8页,共74页，2024年2月25日，星期天第9页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202410键合相固定相：在硅胶的表明用键合反应把官能基团键合到表面上，解决固定相流失的问题。正相色谱：流动相极性比固定相极性小反相色谱：流动相极性比固定相极性大键合相液相色谱第10页,共74页，2024年2月25日，星期天第11页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202412高效液相色谱——固定相

化学键合相硅胶

octadecylSi-[CH2]17-CH3C18octylSi-[CH2]7-CH3C8cyanopropylSi-[CH2]3-CNCNaminopropylSi-[CH2]3-NH2NH2

第12页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202413固定相的其他性能

载体的形状球形无定形粒径3~10μm,1.7~2.5μm孔径<150Å分析分子量<2000的化合物;>300Å分析分子量>2000的化合物表面积键合基团的表面覆盖度含碳量第13页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202414一般认为键合相色谱的机理分配色谱机理，也有人认为它是吸附色谱机理，其实应该是有两种成分在里面，现在又有疏溶剂理论等机理的提出。第14页,共74页，2024年2月25日，星期天高效液相色谱仪器第15页,共74页，2024年2月25日，星期天第16页,共74页，2024年2月25日，星期天储存和输送液体设备进样系统柱系统检测器控制和数据处理系统第17页,共74页，2024年2月25日，星期天选择流动相的原则：保持色谱柱的稳定性化学惰性适合所用的检测器对样品有一定的溶解能力清洗、更换方便、毒性小沸点、粘度等物理性质合适第18页,共74页，2024年2月25日，星期天反相色谱最常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。水－甲醇体系：大约50％水的时候粘度最大水－乙腈体系：35％水的时候粘度最大。第19页,共74页，2024年2月25日，星期天存放流动相的容器一定要惰性的，并且有机溶剂要避光。输液泵要求流量平稳,可以调节的流量范围宽，耐高压。一般是柱塞往复泵。第20页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202421第21页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202422流动相的混合输入和洗脱方式离线混合配制滤过脱气

在线混合低压在线混合高压在线混合洗脱等度洗脱梯度洗脱第22页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202423高效液相色谱仪器——泵系统第23页,共74页，2024年2月25日，星期天进样系统包括手动进样和自动进样无论手动进样还是自动进样，都要通过六通阀。六通阀进样是高压系统的需要，既不影响系统的正常运行又能够让样品进到系统中去。第24页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202425第25页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202426高效液相色谱仪器——进样器第26页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202427反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。柱温箱的温度控制要求比较精确，因为流体的粘度受温度的影响较大。柱系统包括色谱柱和柱温箱第27页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202428测量原理不同分类：光学性质检测器电学和电化学性质检测器热学性质检测器液相色谱检测器第28页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202429紫外－可见光检测器示差折光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器化学发光检测器光学性质检测器：第29页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202430高效液相色谱仪器——检测器第30页,共74页，2024年2月25日，星期天紫外吸收检测器有三种类型：固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm或280nm紫外光。可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光光二极管阵列检测器photo－diode－arraydetector（PDAD，PDA,DAD）：钨灯和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。PDA可以辅助定性。第31页,共74页，2024年2月25日，星期天DAD检测器3D图第32页,共74页，2024年2月25日，星期天示差折光检测器（refractiveindexdetectorRID）：溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积之和。RID是通用型的检测器，但是灵敏度不高。RID不能用于梯度洗脱。第33页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202434蒸发光散射检测器第34页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202435安培检测器电导检测器库仑检测器介电常数检测器极谱检测器电学和电化学检测器：第35页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202436完成数据采集和对仪器的控制。工作站：第36页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202437超高效液相色谱仪（UPLC）超高效液相色谱是分离科学中的一个全新类别，它给实验室带来了新奇而强大的能力。UPLC™借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。第37页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202438高效液相色谱法在药典中的应用项目2000版2005版含量测定109527第38页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202439HPLC与TLC比较(2005版)含量测定TLC-SCHPLC药材和提取物15175中成药35352第39页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202440HPLC在中药质量分析和检测中的应用有效成分、指标成分的检测；杂质或有关物质检查；添加物或有害残留物质的检测；中药指纹谱分析第40页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202441有效成分、指标成分的检测

人参皂苷的检测第41页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202442Flavones,Flavanones,andFlavanoneGlycosides

PeakIdentification

1.

Naringin

2.

Neohesperidin

3.

Myricetin

4.

Quercetin

5.

Naringenin

6.

KaempferolColumn:AlltimaC18,3µm,100x4.6mm

MobilePhase:A:50mMPotassiumPhosphate,pH2.5B:ACN

Gradient:(Time,%B)(0,20)(15,40)

FlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat280nm

第42页,共74页，2024年2月25日，星期天Ginkgolides

PeakIdentification

1.

GinkgolideJ

2.

GinkgolideC

3.

GinkgolideA

4.

GinkgolideB

Column:NucleosilC18,5µm,250x2.1mm

PartNo.C-6000B

MobilePhase:Water:Methanol:Tetrahydrofuran(70:20:10)

FlowRate:0.2mL/min

Detector:500ELSD

第43页,共74页，2024年2月25日，星期天杂质或有关

物质检查第44页,共74页，2024年2月25日，星期天添加物或有害残留物质的检测

OrganophosphatePesticides

PeakIdentification

1.

MethylParathion

2.

Dichlorvos

3.

Ethoprophos

4.

Azinphos

Column:AlltimaHPEPSC18,5µ,150x4.6mm

MobilePhase:(40:60)methanol:water

FlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat214nm

第45页,共74页，2024年2月25日，星期天添加物或有害残留物质的检测

AflatoxinStandards

PeakIdentification

1.

AflatoxinG2

(0.06µg/mL)

2.

AflatoxinG1

(0.20µg/mL)

3.

AflatoxinB2

(0.06µg/mL)

4.

AflatoxinB1

(0.20µg/mL)

Column:InertsilODS-3V,5µ,150x4.6mm

MobilePhase:(50:50)Methanol:WaterFlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat365第46页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202447中药指纹谱分析第47页,共74页，2024年2月25日，星期天第48页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.2024492005版HPLC方法应用有效成分\特征成分含量测定多成分指标含量测定多种检测器应用第49页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202450有效成分\特征成分含量测定第50页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202451有效成分\特征成分含量测定第51页,共74页，2024年2月25日，星期天多成分指标含量测定第52页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202453ELSD检测方法应用第53页,共74页，2024年2月25日，星期天银杏叶提取物中银杏酸的限量检查第54页,共74页，2024年2月25日，星期天含量样品以总酸计ppm以银杏酸13：0计ppm样品10.40.4样品20.20.2样品30.40.4样品43.83.8样品52728样品616671662样品7524522样品823392333样品9392390样品10316315第55页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202456

高效液相色谱法附录修订内容(2005版)

修订内容和特点：明确了HPLC方法的几种分离机制，为分类应用提供了基础；明确了数据处理系统（色谱工作站）作为色谱信号记录;以较大篇幅增加了色谱柱、检测器、流动相的内容，适应快速发展的、日趋成熟的HPLC技术的要求。第56页,共74页，2024年2月25日，星期天高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。高效液相色谱法的主要分离机制有吸附、分配、离子交换和排阻作用。 2000版2005版第57页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202458对仪器的一般要求(2000版)所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂，用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法(附录ⅤA)项下对溶剂的要求。第58页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202459对仪器的一般要求(2005版)

1

所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。（1）色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。第59页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202460对仪器的一般要求(2005版)

2

填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在150Å以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在300Å以上的填料。第60页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202461对仪器的一般要求(2005版)3

以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。第61页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202462对仪器的一般要求(2005版)4(2)检测器最常用的检测器为紫外吸收检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测物的质量有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器属质量型检测器，对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱测定和色谱峰纯度的检查。

第62页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202463对仪器的一般要求(2005版)5紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测物的质量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测物的质量通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外-可见分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。第63页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202464对仪器的一般要求(2005版)5

（3）流动相由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常不应低于5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。

第64页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202465梯度洗脱

按设定的时间程序改变流动相系统溶剂组成的比例的洗脱方法.

例:“以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱”(人参)第65页,共74页，2024年2月25日，星期天第66页,共74页，2024年2月25日，星期天26.03.202467梯度洗脱以有机溶剂相作为流动相A，以水相（含酸、盐等）为流动相B；使用混合流动相的，以含有机相比例较高的为流动相A，含水比例高的为流动相B。第67页,共74页，2024年2月25日，星期天正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。

正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定适用牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。第68页,共74页，2024年2月25日，星期天按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。

色谱系统的适用性试验通常包括分离度、理论板数、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用