高效液相色谱在制药行业中的应用

关于高效液相色谱在制药行业中的应用第2页,共69页，2024年2月25日，星期天

北京创新通恒科技有限公司是一家面向全球的专业HPLC企业，主要致力于高效液相色谱系统研制、开发、生产和销售。创建于2000年，公司总部位于北京市海淀区中关村高科技园区上地信息产业基地，是一家极具创造力的国家级高新技术企业。十年来一直秉承“精益求精，追求品质，值得信赖”传统，根据用户需求，在用户关键领域进行持续的技术研发。我们拥有卓越的技术团队和专家级的一流研发人才，“CXTHDAC800工业化生产型HPLC系统”研发投产，将中国工业化色谱系统推向世界前列，这是中国大型纯化分离研发领域的一座里程碑；“CXTHKilotide500DNA合成仪”投入使用，弥补中国大型合成设备领域的空白。

关于我们第3页,共69页，2024年2月25日，星期天国家级高新技术企业国家级软件产品企业创新通恒科学技术部技术创新基金国家级、北京市创新基金关于我们第4页,共69页，2024年2月25日，星期天软件著作权7项仪器仪表协会创新金奖DAC800大型工业化制备色谱系统BCEIA金奖发明专利3项，实用新型专利13项公司资质、奖项第5页,共69页，2024年2月25日，星期天第6页,共69页，2024年2月25日，星期天北京创新通恒科技有限公司北京钢臣科技有限公司总经理办公室开发部财务部营销事业部中小设备加工中心应用技术发展部工业化设备加工中心上海办事处成都办事处广州办事处售后技术支持中心组织构架第7页,共69页，2024年2月25日，星期天走近我们第8页,共69页，2024年2月25日，星期天引言：HPLC的特点HPLC在制药行业中的应用药物色谱分析方法的开发药物色谱纯化方法的建立和优化：从分析到工业制备目录内容提要第9页,共69页，2024年2月25日，星期天引言HPLC的特点：高效：分离效能高高灵敏度应用范围广：70%以上的有机化合物可以用HPLC分析分析速度快条件温和，样品不被破坏分析HPLC由于灵敏度高，快速简便，广泛地应用于药物分析制备HPLC是目前分离与纯化领域中处理多组分复杂体系的最有效的方法第10页,共69页，2024年2月25日，星期天引言：HPLC的特点HPLC在制药行业中的应用药物色谱分析方法的开发药物色谱纯化方法的建立和优化：从分析到工业制备目录内容提要第11页,共69页，2024年2月25日，星期天分析型HPLC在制药行业中的应用检测药物含量天然药物化学成分复杂，有效成分可能有一个，也可以有多个，因此精确测定各有效成分的含量对药品质量控制，建立质量标准具有重要的意义。高效液相色谱法由于其专一性、灵敏度高、快速简便的特点可广泛应用于药物分析中的定量分析，尤其在干扰因素见多的时候表现出更大的优越性。药效检测：药物代谢动力学研究，新药效能研究检测药物残留第12页,共69页，2024年2月25日，星期天三七药材组分分析：第13页,共69页，2024年2月25日，星期天感冒清热颗粒中的葛根素有效成分分析：第14页,共69页，2024年2月25日，星期天

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第17页,共69页，2024年2月25日，星期天半制备型HPLC在制药行业中的应用高通量筛选活性物质实验室规模纯化（克级）第18页,共69页，2024年2月25日，星期天DISCOVERYACTIVECOMPONENT发现活性高通量筛选活性物质第19页,共69页，2024年2月25日，星期天中药提取物或发酵液等的分析谱图哪个才是活性组分？高通量筛选活性物质第20页,共69页，2024年2月25日，星期天用半制备色谱系统，对可能具有生物活性的组分，多次进样，分段制备几十毫克做活性研究，最终确定活性组分高通量筛选活性物质第21页,共69页，2024年2月25日，星期天第22页,共69页，2024年2月25日，星期天制备HPLC在制药行业中的应用纯化药物有效成分高附加值产品（如紫杉醇、长春碱等癌症治疗药物）上样量大，附加值低产品（甜菊糖苷等附加值低的药物辅料）工艺改进类产品（增大生产量或提高产品纯度类产品）第23页,共69页，2024年2月25日，星期天制备HPLC在制药行业中的应用第24页,共69页，2024年2月25日，星期天

小试级制备色谱系统：方法的放大及标准品、对照品的制备。第25页,共69页，2024年2月25日，星期天中试级制备色谱系统：年产公斤级至百公斤级第26页,共69页，2024年2月25日，星期天DAC800型工业化色谱：

年产吨级第27页,共69页，2024年2月25日，星期天引言：HPLC的特点HPLC在制药行业中的应用药物色谱分析方法的开发药物色谱纯化方法的建立和优化：从分析到工业制备目录内容提要第28页,共69页，2024年2月25日，星期天液相色谱实验所需的基本参数流动相：种类及配比，等度或梯度固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器参数温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件药物色谱分析方法的开发第29页,共69页，2024年2月25日，星期天高压输液泵的选择平流（单泵）高压梯度使用多台色谱泵，在泵后混合配置灵活、简单，脱气简单低压梯度用单泵产生梯度，泵前混合对脱气要求高第30页,共69页，2024年2月25日，星期天检测器的选择a、紫外可见光检测器应用最广泛的检测器，是在UV及VIS区有吸收物质检测的首选检测器。b、示差折光检测器一种通用型的检测器，灵敏度偏低，对温度稳定性要求过高，不能用于梯度洗脱。通常用来分析糖类及高聚物（GPC）c、荧光检测器灵敏度极高，常用来进行痕量检测。d、二极管阵列检测器（DAD）可用于全波长的检测，可以测量峰纯度，可在线得到色谱图和光谱图。e、蒸发光散射检测器一种通用型检测器，它可以检测挥发性低于流动相的任何样品。ELSD可以用于测量无生色团物质的检测，如碳水化合物、类脂物、聚合物、不进行衍生化的脂肪酸及氨基酸、表面活性剂及结构不明又无标准的物质的检测。第31页,共69页，2024年2月25日，星期天根据分离模式划分的色谱柱类型色谱柱的选择第32页,共69页，2024年2月25日，星期天第33页,共69页，2024年2月25日，星期天常用色谱柱类型1.ODS（C18）—应用范围最广的填料，大部分小分子有机化合物都可进行分析2.C8、C4—保留要比C18弱，适合用于大分子的多肽和蛋白类的分离纯化3.氨基柱—正反双模式，主要用于小分子糖类化合物4.苯基柱—通常用于分离含苯环的化合物5.氰基柱—正反双模式，和ODS基不同的色谱间作用力，因而氰基柱拥有独特的选择性6.正向硅胶7.环糊精—根据物质光学性质的不同进行手性分离第34页,共69页，2024年2月25日，星期天进样系统的选择

六通进样阀六通阀的构造a.Load状态b.Inject状态

自动进样器第35页,共69页，2024年2月25日，星期天为保证重现性以及峰形等，很多情况下需要使用柱温箱来控制柱温。选配：恒温装置第36页,共69页，2024年2月25日，星期天引言：HPLC的特点HPLC在制药行业中的应用药物色谱分析方法的开发药物色谱纯化方法的建立和优化：从分析到工业制备目录内容提要第37页,共69页，2024年2月25日，星期天药物色谱纯化方法的建立和优化：从分析到工业制备理论的放大设备的放大第38页,共69页，2024年2月25日，星期天分析型色谱：线性色谱指组分在固定性和流动相中的平衡浓度呈正比例关系，即吸附（分配）等温线为一条直线。用于分离和鉴别样品中的组分，为此希望能在尽可能小的进样量下，提供尽可能高的组分分辨率。制备色谱：非线性色谱在制备色谱中，进样量一般都比较大，例如在克量级范围，这时样品在流动相和固定相中的比例不再是正比例的关系，相对应的吸附（分配）等温线将发生弯曲。用于分离、富集或纯化混合物中的某一或某些组分，为此需要一定的处理量，一般进样量比分析型色谱大得多。能有适当的分离度，并要考虑层析分离过程的规模、速率和分离成本。理论的放大：非线性色谱第39页,共69页，2024年2月25日，星期天线性色谱分析制备非线性色谱理论的放大：非线性色谱第40页,共69页，2024年2月25日，星期天制备色谱峰型理论的放大：非线性色谱第41页,共69页，2024年2月25日，星期天色谱峰型不再对称色谱峰的保留时间随着进样浓度而变化色谱峰高度（峰面积）与进样浓度不成正比非线性色谱的特点理论的放大：非线性色谱第42页,共69页，2024年2月25日，星期天浓度超载进样体积超载进样PKLangmuir型容量因子降低，峰形从高斯曲线变为三角形提高样品的浓度，保持进样体积不变；取决于组分在流动相中的溶解度峰高不变，峰变宽并呈矩形取决于进样体积，生产效率决定于制备柱直径，需要小颗粒填料理论的放大：过载进样第43页,共69页，2024年2月25日，星期天理论的放大：过载进样第44页,共69页，2024年2月25日，星期天理论的放大：过载进样应尽可能选用流动相来溶解样品，但应注意样品在流动相中应有良好的溶解度。同时，若样品体积太大，分辨能力就会下降；若样品过浓，则可能在柱的顶部形成沉淀。尽管如此，为每次可分离得到更多的样品，还是应在小体积的流动相中溶解较多的样品。可将样品溶于不同于流动相的溶剂，但用此法时需很谨慎。第45页,共69页，2024年2月25日，星期天设备的放大：分析设备与制备设备分析制备应用范围定性、定量检测样品的组成定性分析：检测的灵敏度定量分析：分离度、再现性从混合物中提取、分离、纯化样品样品中特定成分的高纯度获取，大量、廉价的制备填料粒径≤5um≥10um流速0.001-9.999ml/min100~80000ml/min进样量0.01-2mg1-500000mg管路1/16”1/8”~1/4进样方式进样阀进样阀或进样泵流动相不回收回收分离方式线性非线性第46页,共69页，2024年2月25日，星期天设备的放大：分析设备与制备设备第47页,共69页，2024年2月25日，星期天设备的放大：分析设备与制备设备更大的容器：储罐流量更大的输液泵≥50ml定量管≥1ml进样泵≥50ml≥10mm法兰柱DAC大体积流通池接溶剂回收系统制备系统第48页,共69页，2024年2月25日，星期天分析制备放大优化分析方法的选择性在分析柱上进行超量载样放大到制备柱设备的放大：过程第49页,共69页，2024年2月25日，星期天原料分析分析柱模拟制备放大至半制备（50DAC）中试放大（150or200DAC)工业化制备（300-800DAC)完全线性放大设备的放大：过程第50页,共69页，2024年2月25日，星期天可完全线性放大原因：可达到30000每米的塔板数，几乎与10um填料的分析柱柱效相当800DAC柱效测试结果图设备的放大：过程第51页,共69页，2024年2月25日，星期天上样量的调整：

mp/ma=lp/la*rp/raL:柱长；m：进样量；r：色谱柱内径p:制备柱；a：分析柱重点122设备的放大：公式第52页,共69页，2024年2月25日，星期天流速的调整：Fp/Fa=Vp/Va=Lp/La*rp/raF

：流速

；V:柱体积；L:柱长；r：色谱柱内径；p:制备柱；a：分析柱重点222设备的放大：公式第53页,共69页，2024年2月25日，星期天梯度的调整方法：tp/ta=Vp/Va*Fp/FaF

：流速

；V:柱体积；t:梯度洗脱时间；p:制备柱；a：分析柱重点3设备的放大：公式第54页,共69页，2024年2月25日，星期天example样品：粗品含量大约68%，白色粉末状固体，对热（能够耐受100摄氏度）和光稳定客户要求：纯化后纯度大于99%，单杂小于0.8%，回收率达到70%1step:了解客户需求从分析到制备的过程：案例第55页,共69页，2024年2月25日，星期天2step:原始样品分析example用分析型HPLC（填料5u甚至更小）对样品进行分离，并对流动相进行改进，直到主峰和杂质完全分离，摸索好的条件用来对以后纯化后的样品进行纯度分析。从分析到制备的过程：案例第56页,共69页，2024年2月25日，星期天example分析条件：甲醇：乙腈：水=81：12：7检测波长：246nm流速：1.0mL/min柱子：C18，5μm，4.6*250mm结果从分析到制备的过程：案例第57页,共69页，2024年2月25日，星期天3step:分析柱模拟制备填料粒径≥10um，4.6*250mm的柱子不加非挥发性的酸碱盐，重新摸索制备条件主峰和杂质分离充分的条件下开始做过载实验将主峰分段收集，一般为分成10段左右分别测定纯度，计算回收率，进一步优化制备条件从分析到制备的过程：案例第58页,共69页，2024年2月25日，星期天example制备条件摸索流动相填料90%甲醇、75%甲醇、75%乙腈、70%乙腈、60%乙腈。4种不同品牌的填料60%乙腈XX牌填料C18-10um-100A确定确定从分析到制备的过程：案例第59页,共69页，2024年2月25日，星期天example分析柱模拟制备谱图结果从分析到制备的过程：案例第60页,共69页，2024年2月25日，星期天4step:确定最大上样量不断增大上样量，直到回收率明显下降理论上样量：填料质量的3‰---8‰，可以从3‰逐渐增大来确定最大上样量第61页,共69页，2024年2月25日，星期天example60%乙腈，进样量4‰时，收率为36.3%60%乙腈，进样量3‰时，收率为78.9%选择上样量为3‰从分析到制备的过程：案例第62页,共69页，2024年2月25日，星期天最终确定的制备条件：流动相：60%乙腈-水上样量：填料质量的3‰填料：XX牌-C8-10um-100A样品溶剂：流动相从分析到制备的过程：案例第63页,共69页，2024年2月25日，星期天5step:放大分析柱模