28.3HLA分型技术讲解

器官移植及免疫学检验教学目标1.掌握：

移植抗原的种类、HLA分型的方法（重难点）；预防移植排斥反应的免疫学检测（重难点）。2.熟悉：器官移植的概念和种类、移植排斥反应的分类（难点）；移植后的免疫学检测。3.了解：移植排斥反应的发生机制。知识目标技能目标思政-素质目标学会常用的HLA分型及交叉配型的方法。责任心、质控及生物安全意识、临床思维一器官移植概述三HLA分型技术四预防移植排斥反应的免疫学措施五移植后的免疫监测六器官移植面临的主要问题和解决方案设想二移植排斥反应血清学分型细胞学分型基因分型

三HLA分型技术SD抗原

HLA-ABCHLA-DRDQ补体依赖的细胞毒(CDC)试验一、HLA血清学分型技术

将待检淋巴细胞与一系列已知抗HLA标准分型血清混合后，抗体会特异性结合表达相应HLA抗原的淋巴细胞，在补体的作用下，引起细胞死亡，死亡的细胞可被台盼蓝等染料染色，而活细胞由于细胞膜完整不着色，根据死亡细胞的百分比，判定其HLA的型别。1.CDC试验原理2.流式细胞仪分析技术LD抗原

HLA-D和DP

混合淋巴细胞培养(MLC)二、HLA细胞学分型技术

两个基因型不同个体的淋巴细胞，在体外进行混合培养时，由于彼此的HLA不同，能相互刺激导致双方淋巴细胞活化增殖和分化，进而表现形态学的变化和细胞的增殖，可通过形态学或3H-TdR渗入试验来检测淋巴细胞反应的强度，从而判定其HLA型别。

单向MLC和双向MLCMLC原理1.RFLP:限制性片段长度多态性分析2.PCR-SSOP：序列特异性寡核苷酸探针-PCR3.PCR-SSP：序列特异性引物-PCR4.PCR-SSCP：单链构象特异性-PCR5.SBT分型法：基于序列的HLA分型法6.多荧光微珠免疫分析7.基因芯片三、HLA基因分型技术

不同个体间的HLA复合体存在核苷酸碱基序列的差异，这种差异造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同，用一组限制性内切酶消化、识别、切割这些位点，产生数量和长度不一的DNA酶解片段，经琼脂糖电泳或用特异性探针与酶解片段进行杂交即可确定HLA的基因型别。也可先对DNA片段进行体外PCR扩增，然后再进行RFLP分析，即PCR-RFLP。1.PCR-RFLP

先对HLA基因片段进行PCR扩增，然后将扩增片段转移至NC膜或尼龙膜上，然后与用放射性核素或酶、地高辛等标记的寡核苷酸探针进行杂交，若待检DNA与探针序列互补，则两者结合，从而确定HLA的基因型别。2.PCR-SSOP

根据各型别HLA核苷酸碱基序列差异，设计出一套HLA等位基因的序列特异性引物，对待测DNA进行PCR扩增，因TaqDNA聚合酶没有3′→5′核酸内切酶活性，引物3′端最后一个碱基是否与模板配对决定着能否扩增出产物。若将引物的3′端最后一个碱基设计在正好有差异的那个碱基序列上，则扩增产物仅需常规琼脂糖电泳，根据特异产物存在与否即可直接对HLA进行分型。3.PCR-SSP

用PCR扩增特定的靶序列,经变性使之成为两条单链,然后在无变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。单链DNA如果存在碱基差异,即使一个碱基的不同,也会表现出电泳迁移率的不同,据此可将不同型别的HLA区分开,达到分型的目的。4.PCR-SSCP

首先用PCR扩增HLA的DNA片段，扩增产物进行纯化和测序，将此序列与HLA基因库的DNA已知序列进行比较，即可获得HLA的基因型别。最可靠也最彻底的基因分型方法。5.SBT分型法

用标记有生物素的特异性引物分别扩增HLA-A、B、DR等基因座位的特异性片段，扩增产物与已知的寡核苷酸探针（事先包被在不同颜色的磁珠上）进行杂交，洗脱没有结合的DNA片段，再与荧光素标记的亲和素结合，多荧光微珠在流式细胞仪上进行结果判读，若扩增的DNA片段能与探针结合则发荧光，不结合则无荧光。6.多荧光微珠免疫分析

首先用PCR扩增获得HLA的DNA片段，用放射性核素或荧光素标记扩增的DNA分子，再与预先点