第10章 吸光光度法教材

吸光光度法第10章第1节物质对光的选择性吸收和光吸收的基本定律一、光的基本性质吸光光度法

是基于被测物质的分子

对光

具有选择吸收的特性而建立的分析方法。光的电磁波性质

射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光400-750nm光的波粒二象性波动性粒子性

E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光电效应E：光子的能量（J,

焦耳）

：光子的频率（Hz,赫兹）

：光子的波长（cm）c：光速（2.99791010cm.s-1）h：Plank常数（6.625610-34J.s

焦耳.秒）

二、可见光与溶液的颜色（物质对光的吸收）物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光单色光、复合光、光的互补单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿物质吸收光的本质光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，这一过程与物质的性质及光的性质有关。物质对光的吸收物质对光的吸收满足Plank条件h

S2S1S0S3E2E0E1E3h

h

h

透光度（透射比）定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光ItIrIa一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质I0=

Ia+It+

Ir

I0=

Ia+It

三、光吸收的基本定律——朗伯—比耳定律（Lambert-beer’slaw）朗伯—比耳定律

Lambert–BeerLawI0dbbItII-dIdI

∝NIN：薄层中的吸光粒子数N=N0cdSdbN0

：阿伏加德罗常数

dS

：捕获面积，薄层中被光照射的面积。c：吸光溶液的浓度N=k′

cdb故

dI

∝NI=Ik′cdbdI=-Ik

cdb,dI/I=-k

cdb积分得或得吸光度A与透光度TAbsorbanceandtransmittanceT：透光率A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%吸光系数和摩尔吸光系数b

：吸光层的厚度，光程，cmc：吸光物质的浓度，g/L,mol/LK：比例常数入射光波长物质的性质温度取值与浓度的单位相关c：mol/LK

摩尔吸光系数，L·mol–1·cm-1c：g/LK

a吸光系数，L·g–1·cm-1c：g/100mLK

比吸光系数相互关系

MolarAbsorptivityAbsorptivity

Specificextinctioncoefficient吸光系数a比吸光系数桑德尔（Sandell

）灵敏度SS值表示光程（pathlenth)为1cm

吸收池测得吸光度为0.001

时，每mL

溶液中待测物质的微克数。单位为

g．cm-2。Sandell

灵敏度与的关系摩尔吸光系数

灵敏度灵敏度吸光度的加合性多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即第2节吸光光度计及吸收光谱

一、光度分析法的几种类型1、目视比色法标准系列（色阶）未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）不可分辨多组分方法简便，灵敏度高2、光电比色法3、分光光度法（紫外-可见分光光度法）UV-VISUltravioletVisualSpectroscopy0.575光源单色器吸收池检测器显示I0It参比样品入射光I0透射光It请注意与定义比较未考虑吸收池和溶剂对光子的作用二、分光光度计及其基本部件紫外-可见分光光度计组件光源单色器吸收池比色皿检测器信号输出氢灯，氘灯，185~350nm；卤钨灯，250~2000nm.基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定作用：将复合光色散成单色光棱镜光栅玻璃，350~2500nm,石英，185~4500nm平面透射光栅，反射光栅玻璃，光学玻璃，石英作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示0.5cm、1cm、2cm、3cm单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示单波长双光束分光光度计差值光源单色器吸收池检测器显示切光器721型分光光度计仪器结构示意图1722型分光光度计吸收光谱（光吸收曲线）测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。(a)(b)(c)(d)220240260280

nm

A0000(a)联苯（己烷溶剂）；一些典型的紫外光谱(b)苯（己烷溶剂）；(c)苯蒸汽；(d)Na蒸汽。吸收光谱的讨论：（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax

（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。ABA

A

C增大（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。（5）在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。吸收定律与吸收光谱的关系AC吸收定律A或

吸收光谱A

C

max第3节显色反应及其影响因素显色反应：在光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的化学反应有机物质官能团强吸收直接测定UV-VIS官能团弱吸收衍生化反应UV-VIS显色反应无机物质通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度332+桔红色

max邻二氮菲显色剂：与被测组分生成有色化合物的试剂

1、对显色反应的要求1、显色反应的灵敏度要高，其摩尔吸收系数应比较大。2、显色反应的选择性要高3、有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定4、对比度要大，即有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。一般要求有色化合物与显色剂的最大吸收波长之差应大于60nm。5、显色过程要易于控制。重现性2、显色剂无机显色剂有机显色剂a.磺基水杨酸属于OO型螯合剂，主要用于测定Fe3+

酸度不同，络合物配比不同，颜色也不同b.丁二酮肟属于NN型螯合剂，主要用于测定Ni2+

形成红色络合物c.1,10-邻二氮菲属于NN型螯合剂，主要用于测定Fe2+

形成橘红色络合物e.偶氮胂Ⅲ（铀试剂Ⅲ）属于偶氮类螯合剂，主要用于测定Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)、U(Ⅳ)等d.二苯硫腙属于含S显色剂，主要是萃取光度法测定Cu2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+等的试剂f.铬天青S

属于三苯甲烷类螯合显色剂，主要用于测定Al3+g.结晶紫属于三苯甲烷类碱性染料，主要用于测定Tl3+a.混配化合物b.离子缔合物c.金属离子-配体-表面活性剂体系3、多元络合物二、影响显色反应的因素1、反应体系的酸度2、显色剂的用量3、显色反应时间4、显色反应温度5、溶剂6、溶液中共存离子的影响1、酸度的选择酸度的影响影响显色剂的平衡浓度和颜色

M+nR=MRnOH-H+影响被测组分的存在状态

RH

=R-+H+

1

2影响络合物的组成

例，磺基水杨酸–Fe3+pH=1.8~2.5FeR紫红色pH=4~8FeR2棕褐色pH=8~11.5FeR3黄色酸度的选择理论计算以作图可得适宜pH范围实际工作中，作A~pH曲线，寻找适宜pH范围。ApHM+nR=MRnOH-H+2、显色剂的用量M+nR=MRn定量反应实际工作中，作A~CR

曲线，寻找适宜CR范围。ACR3、温度的选择实际工作中，作A~T

曲线，寻找适宜反应温度。ATATATATAT4、反应时间的选择实际工作中，作A~t

曲线，寻找适宜反应时间。5．溶剂6．溶液中共存离子的影响第4节吸光光度分析及误差控制测量波长的选择无干扰，选择

max有干“吸收最大，干扰最小”的原则扰，A

A

待测溶液吸光度的选择控制A=0.2~0.8方法选择c选择b1、非单色光影响小2、灵敏度高一、测量条件的选择参比液的选择原则：扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进行讨论M+R=M-R

max试液 显色剂溶剂吸光物质参比液名称及组成无吸收无吸收光学透明溶剂参比溶剂基质吸收无吸收吸收试液参比不加显色剂的试液无吸收吸收吸收试剂参比不加试液的溶液基质吸收吸收吸收吸收退色参比显色剂+试液+

待测组分的掩蔽剂若欲测M-R

的吸收

maxA（样）=A（待测吸光物质）+

A（干扰）+A（池）A（参比）=

A（干扰）+A（池）目的：消除由于吸收池壁及溶剂、试剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并可扣除干扰的影响二、吸光光度分析的方法微量组分的分析单组分的测定纯物质或共存物质不干扰1、标准比较法A=εbcsA=εbcx2、标准曲线法（工作曲线法）横坐标：标准溶液的浓度（加入体积）ACs纵坐标：相应的吸光度cs与cx相近多组分的测定解联立方程法A

XY

1

2根据加合性原则解联立方程，可求得Cx,Cy

为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得。ACs(x)三、对朗伯-比耳定律的偏离主要原因非单色光吸光质点的相互作用负误差正误差介质不均匀引起的偏离1、非单色光引起的对吸光定律的偏离对吸收光谱而言，b和c固定，反映了

随波长变化的情况，单一波长，

固定；不同波长，

不同。因此，非单色光将导致对吸光定律的偏离。A或

1

2在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。

1对应的

1较小

2对应的

2较大选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。2、吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离质点间的静电作用质点间的缔合作用质点间的化学反应例，聚合引起的对吸光定律的偏离单体：2

max=660nm二聚体：

max=610nmAC

max=660nmA

660nm610nm化学反应的影响M+L=ML

max吸光定律光度法测定通常在一个较大的浓度范围内作工作曲线，当

′或随着浓度的变化而变化，或随着副反应的变化而变化时，就表现出对吸光定律的偏离。实际计算四、消除干扰的方法

1、控制溶液酸度2、加入掩蔽剂3、改变干扰离子的价态4、利用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰6、选择适当的波长7、分离干扰离子5、增加显色剂用量五、吸光度测量的误差吸光度标尺刻度是不均匀的光度计中透光度的标尺刻度是均匀的透光度读数误差△T约为±0．01A=εbcdA=εbdcdc为测量结果c的测量误差dA

为测量吸光度A时的测量误差A=－lgT=－0.434lnT

T在15%-65％（吸光度A在0.2-0.8之间），测量的相对误差较小。T=36.8％或A=0.434时，测量结果的相对误差最小。第5节其他吸光光度法示差吸光光度法1、基本原理常规法以空白溶剂为参比示差法以浓度为Cs的标准溶液为参比A△C△CxA′（Cx>Cs）适宜高

浓度的测定思考：（Cx

Cs）时情况怎样？2、示差法的误差方法定量原理相对误差常规法示差法∴Tr>Tx∵I0>Is有结论：示差法提高了准确度例题例题已知dT=0.01,样品Tx=2.00%,标准Ts=10.0%示差法常规法误差示差法误差示差法提高准确度的实质常规法TxT051050100

落在测量误差较大的范围高浓度示差法T051050100TrTsTs

落在测量误差较小的范围示差法通过改变仪器的定位使透射率的刻度标尺读数扩展示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度结论：双波长分光光度法光源单色器单色器检测器切光器狭缝吸收池

不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ2处的吸光度Aλ2作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。

双波长分光光度法21A

XY∵∴Y

的存在不干扰

X的测定因只用一个吸收池，而且以试液本身对某一波长的光的吸光度为参比，因此，消除了因试液与参比液及两个吸收池之间的差异所引起的测量误差，提高了测量的准确度。选择波长组合λ1

、λ2的基本要求：

1、选定的波长λ1和λ2处干扰组分应具有相同吸光度，即：ΔAy=ΔAyλ2

－ΔAyλ1=0故：ΔAx+y=ΔAx=(εxλ2－εxλ1)bcx此时：测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。

可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。

2、在选定的两个波长λ1和λ2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。导数分光光度法在双波长分光光度计上，如果使用的两个波长很接近，进行同时扫描，并保持两波长差不变，便可获得一阶导数光谱。导数光谱：吸光度随波长变化率对波长的曲线n阶导数

1、能够分辨两个或两个以上严重重叠的吸收峰

2、能够分辨吸光度随波长急剧上升处所掩盖的弱吸收峰

3、能够确认宽阔吸收带的最大吸收波长导数光谱谱带比原吸收光谱窄，减少了与干扰谱带交迭的可能性，提高了抗干扰能力。导数光谱可去除背景干扰，提高分别率。

导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。导数分光光度法定量分析的理论基础：1、峰-谷法2、基线法3、峰-零法测量导数光谱峰值的方法：第六节吸光光度法的应用一、痕量金属分析二、临床分析三、食品分析四、其他应用弱酸和弱碱解离常数的测定

设某波长下，HB和B-都有吸收，b=1cm，根据吸光度的加和性：在高酸度时，弱酸几乎以HB形式存在：在强碱性时，弱酸几乎以B-形式存在：∴

络合物的组成的测定摩尔比法测络合比（饱和法）M+nR=MRnCM,固定；CR,从0开始增大在特定波长测定

R=0,

M=0,

MRn

>0ACR/CMn

R>0,

M>0,

MRn

=0ACR/CMn等摩尔连续变化法（Job）测络合比M+nR=MRnCM+CR=常数CM/C从0→1在特定波长测定

R=0,

M=0,

MRn

>000.51.0ACM/C0.33n=1,CM/C=0.5n=2,CM/C=0.3300.51.0ACM/C

R>0,

M>0,

MRn

=0填空

1、苯酚在水溶液中摩尔吸收系数ε为6.17×103moL/L，若要求使用1cm吸收池时的透光度为0.15～0.65，则苯酚的浓度应控制在

2、多组分分光光度法可用解联立方程的方法求得各组分的含量，这是基于

3、在紫外可见分光光度计中，在可见光区使用的光源是灯；用的棱镜和比色皿的材质可以是；而在紫外光区使用的光源是；用的棱镜和比色皿的材质一定是

1、在符合朗伯—比尔定律的范围内，有色物的浓度、最大吸收波长、吸光度三者的关系是

A．增加，增加，增加；

B.减小，不变；减小；

C.减小，增加，增加；

D.增加，不变；减小

2、下列说法正确的