第六章蛋白质的分离纯化

第六章蛋白质的分离纯化第1页，课件共109页，创作于2023年2月一、蛋白质的酸碱性质蛋白质中的功能团

末端α－NH2

末端α－COOH

侧链基团

所以，蛋白质的化学物理性质＝AA第2页，课件共109页，创作于2023年2月

A．蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用。

B．蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团。

C．结合蛋白质辅基成分包含可解离蛋白质

D．末端α-COOH,α-NH2

E．蛋白质分子中可解离基团的pK'和游离AA中相应基团的pK'值完全不相同。

∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响

F．蛋白质可看作一个多价离子第3页，课件共109页，创作于2023年2月蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点第4页，课件共109页，创作于2023年2月等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团界离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称等离子点。特征常数。第5页，课件共109页，创作于2023年2月二．蛋白质分子的大小与形状

㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量

第6页，课件共109页，创作于2023年2月㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率

第7页，课件共109页，创作于2023年2月这样造成两个后果：①SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移动。

②改变了蛋白质单体分子的构象。第8页，课件共109页，创作于2023年2月SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。

电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有下列关系第9页，课件共109页，创作于2023年2月第10页，课件共109页，创作于2023年2月第11页，课件共109页，创作于2023年2月(七)毛细管电泳测定蛋白质的分子质量

毛细管电泳（CE）则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。

第12页，课件共109页，创作于2023年2月(八)质谱测定蛋白质分子量

质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量2000Da以下的多肽；而电喷雾质谱（ESI）可以测5万Da的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmol）量的蛋白质，精确度为0.01%。第13页，课件共109页，创作于2023年2月三．蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀1．蛋白质的胶体性质

蛋白质溶液是分散系统：分散相是蛋白质分子颗粒，分散介质是水。

分散程度胶体系统

分散相质点真溶液（质点是分子，均相系统）第14页，课件共109页，创作于2023年2月分散程度--以分散相质点的直径来衡量根据分散程度：

第15页，课件共109页，创作于2023年2月分散相质点在胶体系统中保持稳定需三个条件：a．分散相质点1-100nmb．分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀c．分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层第16页，课件共109页，创作于2023年2月蛋白质：a.胶体质点的范围c．丁达尔效应

d．布朗运动

e．不能透过半透膜第17页，课件共109页，创作于2023年2月2．蛋白质的沉淀

第18页，课件共109页，创作于2023年2月沉淀蛋白质的方法：

①盐析法：

中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→蛋白质脱去水化层

优点：不引起蛋白质变性

②有机溶剂沉淀法：

极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用

条件：低温操作

缩短时间

第19页，课件共109页，创作于2023年2月③重金属盐沉淀法

当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀

用途：抢救误服重金属盐的病人第20页，课件共109页，创作于2023年2月④生物碱试剂和某些酸类沉淀法

生物碱试剂－－能引起生物碱沉淀的一类试剂

当溶液pH<pI时,蛋白质颗粒带正电荷→易与生物碱试剂,酸根负离子反应→沉淀

用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质第21页，课件共109页，创作于2023年2月⑤加热变性测定法原因：

a．加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层

b．蛋白质处于等电点破坏了带电状态。

用途：制豆腐（加热+少量盐卤）第22页，课件共109页，创作于2023年2月四蛋白质分离提纯的一般原则

蛋白质提纯的总目标--增加制品纯度或比活性、几增加单位蛋白质质量中所要蛋白质的含量或生物活性。第23页，课件共109页，创作于2023年2月①前处理：

第24页，课件共109页，创作于2023年2月材料获得：（一）天然材料：新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。

e.g.钙调素：动物的脑组织，植物花粉

胰蛋白酶抑制剂：大豆种子

溶菌酶：鸡蛋清

抗体：血清（二）基因工程产物：对于天然不易得到的蛋白，通过工程菌或工程细胞表达而获得。第25页，课件共109页，创作于2023年2月②粗分离蛋白质混合提取液

∣

∣盐析法、等电沉淀、有机溶剂

↓

所要蛋白质与其他杂蛋白质分开

特点：简便、处理量大、既能除去大量杂，又能浓缩蛋白质溶液。第26页，课件共109页，创作于2023年2月粗分离（一）破细胞动物，植物细胞：匀浆，研磨大肠杆菌：冻融，超声，溶菌酶第27页，课件共109页，创作于2023年2月（二）抽提

1.pH：选择合适pH的缓冲液，如Tris，磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待分离蛋白在此pH条件下稳定。一般缓冲液浓度为20－50mM。2.温度：低温如4－10℃，蛋白酶活性较低。3.离子强度：如0.1－0.2MNaCl或KCl.4.其他成分：还原剂如NaHSO4，维生素C；巯基保护剂DTT，巯基乙醇；金属螯合剂EDTA，EGTA；蛋白酶抑制剂PMSF。第28页，课件共109页，创作于2023年2月（三）初步分离1.分离细胞器：离心，超离心2.除核酸：酶法DNase,RNase；超声3.除脂肪：丙酮，脂肪酶（四）粗分蛋白

1.盐析：NaCl，(NH4)2SO4沉淀2.有机溶剂抽提：甲醇，乙醇，丙酮3.等电点沉淀：除去杂蛋白4.热变性：除去杂蛋白（五）除盐

1.超滤2.凝胶过滤3.冻干

第29页，课件共109页，创作于2023年2月③细分离第30页，课件共109页，创作于2023年2月④结晶：本身伴随着一定程度的提纯

重结晶：可除去少量夹杂的蛋白质

蛋白质纯度愈高、溶液愈浓就愈容易结晶第31页，课件共109页，创作于2023年2月五蛋白质混合物的分离方法

第32页，课件共109页，创作于2023年2月(一）据分子大小不同的分离方法

1．透析和超过滤

利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。第33页，课件共109页，创作于2023年2月第34页，课件共109页，创作于2023年2月超过滤

利用压力或离心力，强行使水和其他小分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上。第35页，课件共109页，创作于2023年2月2密度梯度（区带）离心原理第36页，课件共109页，创作于2023年2月3凝胶过滤（凝胶过滤层析，分子排阻层析）（分子筛层析，凝胶渗透层析）

根据分子分离蛋白质混合物

第37页，课件共109页，创作于2023年2月⑴凝胶过滤的介质常用介质：(1)Sephadex:(交联葡聚糖)G25,G50,G75,G100Bio-gel:(聚丙烯酰胺)P-6，P-30，P-60，P-100Sepharose:(琼脂糖)2B,4B,6B(2)Sephacryl:S100,S200,S300(3)Superose:HPLC(4)superdex:HPLC第38页，课件共109页，创作于2023年2月

凝胶珠--多孔的网状结构

交联度or孔度（网孔大小）－－决定凝胶的分级范围，即能被该凝胶分离开来的蛋白质混合度的分子量范围。

排阻极限－－表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子量的分子量。第39页，课件共109页，创作于2023年2月凝胶粒度--筛眼（目）数，珠直径表示

∣

－－→与洗脱流速，分辨率有关第40页，课件共109页，创作于2023年2月⑵凝胶过滤的原理

当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外。随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。第41页，课件共109页，创作于2023年2月不同分子大小路径不同

大分子--先洗脱出来

小分子--后洗脱出来第42页，课件共109页，创作于2023年2月第43页，课件共109页，创作于2023年2月有关凝胶柱体积的术语

Vt为凝胶柱床的总体积（totalvolume），常称柱床体积。它可以用水直接测量或按几何形状计算而得。

Ve为某一溶质组分的洗脱体积（elutionvolume）。它是自加样开始到该组分的洗脱峰或洗脱峰上升边缘的半高点出现使所流出的体积。第44页，课件共109页，创作于2023年2月V0为孔隙体积（voidvolume）或称外体积（outervolume）或外水体积。测定不能被凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖（bluedextran，分子量约200000）的洗脱体积可以决定V0。直径均匀的刚性球形颗粒的柱床V0约等于0.35Vt。

Vi为内体积（innervolume）或称水体积，它可由于胶克重乘其吸水值（以毫升/克表示）近似地表示，或直接测出凝胶柱小分子物质（如T2O，tritiumoxide）通过的洗脱体积再减去外体积得来。第45页，课件共109页，创作于2023年2月

Vm为凝胶基质体积（matrixvolume）。

凝胶床内各种体积之间的关系是：

Vt=V0+Vi+Vm

其中，（Vi+Vm）亦即（Vt-V0）是凝胶珠的总体积。

第46页，课件共109页，创作于2023年2月

假定凝胶与待分离的溶质之间不存在相互作用，那么凝胶过滤可以看成是一种液-液分配层析。凝胶珠内的水相是固定相（Vi），凝胶珠外的水相是流动相（V0），溶质在Vi和V0之间分配。能进入Vi的溶质的量决定于它的大小和凝胶孔的大小。溶质在柱中的移动速度取决与它在两相之间的分配系数（Kd）：第47页，课件共109页，创作于2023年2月Kd是溶质分子大小的函数，而与凝胶床的几何形状无关。对于完全被排阻在凝胶珠内外的大分子来说，它们将在同一洗脱峰出现，Ve=V0，Kd=0；对于完全能自由出入凝胶珠内外的小分子，Ve=V0+Vi，Kd=1；对于在分级范围内的中等分子，凝胶珠内部的有些微孔它们能扩散进去，有些则不能，因此一般情况下，Kd总是在0与1之间。

第48页，课件共109页，创作于2023年2月但有时发现Kd＞1，这表明凝胶对溶质有吸附作用。整理上式得：

Ve=V0+KdVi

从这个式子可以看出，某一溶质的Kd就是该溶质能扩散进入珠内的空间部分占其总空间（Vi）的分数。

第49页，课件共109页，创作于2023年2月由于实际测定Vi有困难，所以上述的公式很少使用。经修正，用凝胶珠内的总体积代替上式中的内体积（Vi）来表示Kd，此时Kd改用Kav，称可用分配系数（avaliablecoeffient）：

第50页，课件共109页，创作于2023年2月只要测得Vt，V0和Ve，即可计算Kav值。

对于两种不同分子量和不同Kav值（K‘av和K’‘av）的组分,它们的洗脱体积之差：Vs=V'e-V"e=（K'av-K"av）（Vt-V0）

因此,为了完全分开两种组分,样品的体积一定不能大于Vs。上面这个式子可以用来计算某一提纯过程的最适柱床体积。第51页，课件共109页，创作于2023年2月

处理介质↓装柱↓平衡↓上样↓洗涤↓洗脱↓介质再生层析的一般步骤第52页，课件共109页，创作于2023年2月(二)利用溶解度差别的分离方法等电点沉淀和pH控制

蛋白质处于pI时，净电荷为零。沉淀溶解度最低

pH>pI蛋白质带电，溶解度较大

pH<pI第53页，课件共109页，创作于2023年2月第54页，课件共109页，创作于2023年2月第55页，课件共109页，创作于2023年2月1．

不同蛋白质

∣

↓

等电点不同

∣

∣

pI时溶解度最低

↓

将蛋白质彼此分开第56页，课件共109页，创作于2023年2月2．蛋白质的盐溶和盐析中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响

低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度盐溶

作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子被此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。

同样浓度（摩尔数/升）的两价离子的中性外，如MgCl2\（NH4）2SO4对蛋白质溶解度的影响效果，要比单价离子的中性盐如NaCl,NH4Cl大得多。第57页，课件共109页，创作于2023年2月盐析－－当离子强度增加到足够高时，eg.饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀出来，这种现象叫盐析。

原理－－大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析法－－分离、提纯常用方法。保持蛋白质的天然构象。（NH4）2SO4第58页，课件共109页，创作于2023年2月3.有机溶剂分级法第59页，课件共109页，创作于2023年2月作用原理：

①.有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，。蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。

②.有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。第60页，课件共109页，创作于2023年2月聚乙二醇（水溶性非离子聚合物）可致使蛋白质沉淀。

原理：脱去蛋白质的水化层；聚乙二醇与蛋白质亲水基团发生相互作用，并在空间上阻碍蛋白质与水相接近。

蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与盐浓度，pH，及绝对溶解度无关。其溶解度依赖于聚乙二醇的分子量。第61页，课件共109页，创作于2023年2月4．温度对蛋白质溶解度的影响。0-40摄氏度大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增大

40-50摄氏度大部分蛋白质变得不稳定,开始变性

大多数蛋白质在低温下比较稳定,蛋白质的操作在0摄氏度或更低温度下进行.

第62页，课件共109页，创作于2023年2月糜蛋白酶,胰蛋白酶及其前体的制备

第63页，课件共109页，创作于2023年2月(三)根据电荷不同的分离方法根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。

1．电泳

在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳(elecctropHoresis)或离子泳(ionpHoresis)。第64页，课件共109页，创作于2023年2月

或从方法学的角度给电泳下定义，电泳是在外电场存在下，利用分子携带的净电荷不同分离分子混合物的一种实验技术。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋曰质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。第65页，课件共109页，创作于2023年2月

带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用：

F(电场力)=qE(=qU/s)

Ff(摩擦力)=fv

第66页，课件共109页，创作于2023年2月这里，q＝颗粒所带的电量

E＝电场强度或电势梯度＝U/q

U＝两电极间的电势差(以伏特表示)

S=两电板之间距离(以厘米表示)

f＝摩擦系数(与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关)

v＝颗粒泳动速度(以厘米／秒表示

第67页，课件共109页，创作于2023年2月当颗粒以恒稳速度移动时，则F-Ff=0，因此，qE=Fv，即，

v/E=q/f

在一定的介质中对其一种蛋白质禾说，q/F是一个定值，因而v/E月也是定值，它被称为迁移率或泳动度：

u=v/E第68页，课件共109页，创作于2023年2月

u值可以通过实验测得，蛋白质的u值为0.1*10-4--1.0*10-4厘米2·伏特-1·秒-1。蛋白质的泳动度以及pH和离子强度对泳动度的影响都反映某一特定蛋白质的特性。因此电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯厦的重要手段而且也是研究蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。第69页，课件共109页，创作于2023年2月电泳基础：自由电泳（移动界面电泳）

a.先在u-形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间形成清晰的界面

b.加电场

c.由于界面处存在浓度梯度，因而产生折射率梯度。利用光学系统可以观察到界面的移动。每个移动界面相当于一个特定蛋白质。

第70页，课件共109页，创作于2023年2月区带电泳

是由于在支持物上电泳时各组分因迁移数度不同分布成区带而得名。

按支持物介质的物理性状：四类区带电泳：

1.滤纸电泳.薄膜电泳(醋酸纤维薄膜电泳,薄膜电泳)

2.粉末电泳:淀粉.纤维层.硅胶粉

3.细丝电泳:尼龙丝,人造丝

4.凝胶电泳:聚丙烯酰胺.琼脂糖凝胶第71页，课件共109页，创作于2023年2月第72页，课件共109页，创作于2023年2月第73页，课件共109页，创作于2023年2月盘状电泳在区带电泳基础上发展起来的。

支持物－－聚丙烯酰胺凝胶第74页，课件共109页，创作于2023年2月三种物理效应：1。样品的浓缩效应

2。凝胶对分子的筛选效应

3。电泳分离的电荷效应样品分离效果好、分辨率等。第75页，课件共109页，创作于2023年2月

等电聚焦（电聚焦）蛋白质混合物的分离是在具有pH梯度的介质中进行的。

用聚丙烯酰胺代替蔗糖溶液

介质固体化、操作方便、分离快

蛋白质"聚焦"在等于其等电点的pH点处，形成一个很窄的区带。第76页，课件共109页，创作于2023年2月双向电泳--AA混合物一次电泳不能完全分开,将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触吸印转移到第二个支持介质上,旋转90℃进行第二次电泳,称双向电泳.

优点:设备简单.操作方便,样品用量少第77页，课件共109页，创作于2023年2月第78页，课件共109页，创作于2023年2月1975年，O’Farrell首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。第79页，课件共109页，创作于2023年2月2．离子交换层析原理：根据蛋白质等电点的差异将不同蛋白质分开。离子交换介质：

(1)离子交换树脂(2)离子交换纤维素(3)SepharoseFastFlow:(4)SepharoseHighPerformance：分辨率较F.F.高(5)Mono:HPLC第80页，课件共109页，创作于2023年2月I分类：阴离子交换强度功能基团

+DEAE中等－OCH2CH2NH(CH2CH3)2

+QAE强－OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3阳离子交换强度功能基团CM弱－OCH2COO-SP强－CH2CH2CH2SO3-II选择：i根据蛋白质的等电点选择介质ii根据分离目的选择介质第81页，课件共109页，创作于2023年2月例如：

离子交换纤维素――纤维素为交换基质原理：具有松散的亲水性网状结构，吸较大的表面积，大分子可以自由通过优点：交换容量大

洗脱条件温和

回收率高

品种多，选择范围广第82页，课件共109页，创作于2023年2月离子交换葡聚糖――基质：交联葡聚糖

优点：交换容量比离子交换纤维素大3－4倍。

能根据净电荷

分子大小分离第83页，课件共109页，创作于2023年2月第84页，课件共109页，创作于2023年2月第85页，课件共109页，创作于2023年2月蛋白质混合物的分离由

溶液中的盐离子强度

pH来完成

结合力小蛋白质先由层析柱中洗脱出来

洗脱时保持洗脱剂成分不改变

改变洗脱剂的盐浓度、PH值第86页，课件共109页，创作于2023年2月跳跃式分段改变（分段洗脱）渐进式连续改变（梯度洗脱）

梯度洗脱优点：分离效果好

分辨率高

适合：交换容量小，对盐敏感的离子交换剂第87页，课件共109页，创作于2023年2月两种混合器:简单型混合器

复合型混合器第88页，课件共109页，创作于2023年2月第89页，课件共109页，创作于2023年2月注意的问题：

(1)缓冲液的选择：阳离子：Tris阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐(2)介质处理：阳离子：Na+型阴离子：Cl-型(3)洗脱：原理：i改变盐浓度ii改变pH值方式：i分步洗脱ii梯度洗脱(4)介质再生第90页，课件共109页，创作于2023年2月第91页，课件共109页，创作于2023年2月（四）蛋白质的选择吸附分离吸附层析--利用吸附力的强弱不同而达到分离的目的。

吸附剂--结晶磷酸钙及羟基磷灰石

蛋白质分子中带负电荷的基团，与羟基磷灰石的钙离子结合。用磷酸缓冲液

羟基磷灰石--分离核酸：病毒。

活性C硅酸AL2O3磷酸钙--吸附层析第92页，课件共109页，创作于2023年2月（五）根据对配基的生物学特异性的分离方法--亲和层析基础：

基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另一种称配基的分子能特异而非共价的结合）

配基：能被生物大分子所识别并于之结合的原子，原子团，和分子：酶--底物;激素--受体；抗原：抗体。第93页，课件共109页，创作于2023年2月原理先把待提纯的某一蛋白质的特异配基，通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上，在配基与多糖基质间迁入一个连接臂使配基于凝胶之间保持足够的距离，不改变载体表面的空间位阻妨碍等待分离的大分子与其配基的结合。

第94页，课件共109页，创作于2023年2月第95页，课件共109页，创作于2023年2月待提纯的蛋白质样品+多糖材料

↓

待提纯的蛋白质样品与配体

结合，吸附，在琼质糖颗粒上

↙↘

结合在柱上的蛋白

其它蛋白

可以用自由配体的

分子溶液脱下来第96页，课件共109页，创作于2023年2月1原理：利用蛋白质特异性进行分离。2介质准备：

载体选择：Sepharose4BSepharoseCL4B,SepharoseFastFlow,SepharoseHighPerformance

空间臂：偶联小分子时需要空间臂，常为双功能基团，如己二氨或ε－氨基己酸。

第97页，课件共109页，创作于2023年2月3配基选择：

抗原――抗体，酶――抑制剂，酶――底物，激素――受体，金属结合蛋白――螯和剂，含巯基蛋白――Hg或含巯基分子，凝集素――糖蛋白4偶联：

I溴化氰法：与α－氨基或ε－氨基偶联。效率高，反应时间短，条件温和，适于多种蛋白。

II环氧氯丙烷法：与－NH2,―OH,―SH偶联偶联时需强烈条件，如pH11，40－50℃，适于特别稳定的蛋白第98页，课件共109页，创作于2023年2月第99页，课件共109页，创作于2023年2月六．蛋白质含量的测定与纯度的鉴定分析工作：

（一）测定蛋白质的总量；

（二）测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量；

（三）鉴定最后制品