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文档简介

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程2005-02-17发布国家质量监督检验检疫总局I本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程本标准规定了直接免疫荧光试验检测非洲猪瘟病毒的方法。本标准适用于非洲猪瘟病毒的检测。2.1冷冻切片机。2.2恒温培养箱。2.3荧光显微镜。2.5leigton管(160mm×16mm)。3.1非洲猪瘟标准毒株。3.2非洲猪瘟荧光抗体：使用前用稀释液稀释至工作浓度。3.3蒸馏水(pH7.4),配制方法参见附录A。3.5缓冲甘油：使用中性无自发荧光的甘油(分析纯)配制，配制方法参见附录A。4.1待检组织制备4.1.2白细胞培养物涂片4.1.2.1配制组织悬液用组织研磨器或捣碎器将被检组织磨碎，加入0.01mol/LpH7.4PBS和抗菌素，配制成20%的组织悬液(每毫升组织悬液的抗菌素含量为：青霉素1000IU,链霉素1mg,庆大霉素50IU,制霉菌素4.1.2.2制备白细胞采取健康猪血，用玻璃珠脱纤或用肝素抗凝(每毫升猪血含肝素100IU),700g离心30min,吸出血清或血浆备用。另外吸取白细胞，并用细胞基础培养液洗涤3次，备用。4.1.2.3配制细胞培养液用上述血清或血浆加细胞基础培养液配制成细胞培养液，使血清或血浆的终浓度为10%～30%。24.1.2.4培养白细胞每管1.5mL,将试管与水平面成5°~10°倾斜放置，置于5%二氧化碳环境中，37℃培养2d～4d。每份组织悬液接种3管白细胞培养物，每管接种0.2mL。置于5%CO₂环境中，37℃培取1管白细胞培养物接种非洲猪瘟标准毒株作阳性对照。另取1管白细胞培养物不接种病毒作阴性对照。分别将上述标本在室温下自然风干，用预冷丙酮固定10min。将上述标本分别用0.01mol/LpH7.4PBS漂洗3次，每次5min,最后用蒸馏水漂洗3min。4.4加荧光抗体在标本上滴加上作浓度的非洲猪瘟荧光抗体，然后将标本放入湿盒内，置于37℃恒温培养箱内温育1h。重复4.3,自然风干。于标本上滴加1滴缓冲甘油，置荧光显微镜下检查。5结果判定(资料性附录)试剂配制用盐酸或氢氧化钠调蒸馏水的pH值至7.4。A.20.01mol/LpH7.4PBS(磷酸缓冲盐溶液)磷酸二氢钾(KH₂PO₄)磷酸氢二钠(Na₂HPO·12H₂

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