猪传染性胃肠炎病毒全基因组克隆及N蛋白的表达的开题报告

猪传染性胃肠炎病毒全基因组克隆及N蛋白的表达的开题报告一、选题背景及意义猪传染性胃肠炎（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是一种由猪传染性胃肠炎病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的急性胃肠炎。病毒于20世纪70年代从欧洲传入美国，后在亚洲和欧洲广泛传播，导致猪类生产业出现了严重的经济损失。病毒对幼年猪特别致命，死亡率可以高达100%。虽然PEDV在已有的病毒大流行中比较常见，但是新出现的PEDV亚型依然很容易造成严重的经济后果。因此研究PEDV成为当前猪类养殖的热点问题。PEDV是一种单股正链RNA病毒，属于科学家们称之为冠状病毒的这一病毒家族。PEDV的基因组大约有28kb，含有6个读码框（ORF）。其病毒颗粒大小在60~140nm之间，具有表面的突起结构。尽管PEDV的基本生物学和分子特征已被广泛研究，但对其致病机制和免疫防御机制的理解仍然不足。基于上述原因，本项目旨在利用分子生物学技术构建PEDV全基因组的克隆体，并进一步表达其N蛋白。该研究可为深入研究PEDV的生物学和分子机制提供必要的工具和基础。二、研究目的本研究旨在将PEDV全基因组进行克隆，并通过表达其N蛋白，进一步了解PEDV的致病机制和免疫防御机制。三、研究内容本研究共包括以下三个方面的内容：1.PEDV全基因组的克隆采用RT-PCR和RACE技术构建PEDV全基因组的克隆即包括6个ORF的cDNA子库。相关的反向和正向引物将分别设计以扩增比较全长的病毒基因组。随后，利用pMD19T-Vecter系统获得目标基因插入质粒，并得到获得目标基因插入质粒的表达菌株。2.PEDV全基因组的序列分析获得PEDV全基因组cDNA之后，通过双向测序，利用序列编辑软件进行序列拼接，获得PEDV全基因组序列。随后，将所获得的PEDV全基因组序列与NCBI中病毒序列数据库进行比对，并进行序列分析。3.PEDVN蛋白的表达利用基因工程技术，将PEDV的N蛋白的蛋白质表达载体构建完成，并利用转染技术表达其蛋白。通过蛋白分离和鉴定分析检测表达情况，并采用免疫印迹等方法进行检测。四、拟解决的问题该研究拟解决PEDV的全基因组的克隆以及其N蛋白的表达问题，通过研究了解PEDV的致病机制和防御机制。并提高人们对PEDV的认识，为今后研究此病毒提供一定的基础。五、研究预期成果1.成功克隆PEDV全基因组，并对其进行序列分析，从而更深入地了解PEDV的生物学与分子特征。2.成功表达PEDV的N蛋白，并对其进行鉴定和检测。为进一步研究PEDV的致病机制和防御机制提供必要的实验基础。3.本研究成果还将为PEDV的防治提供科学依据，为猪类生产业的可持续发展做出贡献。六、研究方法1.病毒菌株的分离与提取RNA收集病毒，并利用RNA提取试剂盒提取病毒的RNA。2.RT-PCR扩增利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增PEDV基因组的cDNA。3.6个ORF的插入质粒的构建将所扩增的PEDV基因组的cDNA通过pMD19-Tvector转化至E.coli中，得到3个插入质粒。4.双向测序及序列分析使用Sanger测序技术进行PEDV全基因组序列的双向测序，利用序列编辑软件进行序列拼接和分析。5.PEDVN蛋白表达载体的构建将所克隆的PEDV的N蛋白接向pET28a(+)载体进行重组，获得表达载体。6.经过IPTG诱导的N蛋白表达将表达载体转化至BL21(DE3)E.coli并经过IPTG诱导表达PEDV的N蛋白，获得表达产物。7.蛋白印迹检测通过免疫印迹等方法测定PEDVN蛋白的表达情况。七、进度安排本研究拟申请2年时间进行，进度安排如下：第一年：1.病毒菌株的分离和RNA提取。2.PEDV全基因组的克隆。3.PEDV全基因组的测序和序列分析。第二年：1.构建PEDVN蛋白表达载体。2.PEDVN蛋白的表达和检测。3.数据分析和总结。八、参考文献1.李玲玲,尹建庆.猪流行性腹泻病毒研究进展[J].中国畜牧兽医,2013,3(40):7-12.2.Song,D.,&Park,B.(2012).Porcineepidemicdiarrhoeavirus:acomprehensivereviewofmolecularepidemiology,diagn