高三生物一轮复习基因工程基因工程的基本工具和基本操作程序

第6课时基因工程的基本工具和基本操作程序1.基因工程的概念别名

技术操作环境生物体外操作对象______操作水平

水平结果创造出更符合人们需要的新的

和__________重组DNA基因DNA分子生物类型生物产品一、重组DNA技术的基本工具2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)黏性末端原核生物数千特定核苷酸序列磷酸二酯键限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？细菌的限制酶不切割自身DNA,原因是细菌细胞内自身的限制酶识别位点进行了修饰(如果DNA甲基化),或是不存在该酶的识别序列以避免被限制酶切割。(2)DNA连接酶磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端与DNA有关的几种酶的比较归纳提升(3)载体环状双链DNA分子噬菌体有一个至多个自我复制受体DNA标记注意

天然的质粒一般不完全具备上述条件,往往需要进行人工改造后才能用作基因工程载体。2.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子B.在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点C.携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随

后者的复制而复制D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择√p365(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。

用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列和切点限制酶Ⅱ的识别序列和切点延伸应用图解限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。延伸应用(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。1.DNA的粗提取与鉴定(1)基本原理不溶于2mol/L二苯胺二、DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定(2)操作流程95%沸水1.过滤时应选用纱布而不是滤纸,如果用滤纸可能会把DNA分子吸附在滤纸上。2.低温操作能防止DNA酶降解DNA。3.粗提取的DNA可能含有核蛋白、多糖等杂质。2.PCR

和扩增目的基因a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据

的原理，在体外提供参与DNA复制的各种

与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行

的技术。b.PCR反应的条件：一定的

、DNA模板、2种

、4种______

、

DNA聚合酶，以及能自动调控

的仪器。获取DNA半保留复制组分大量复制缓冲溶液引物脱氧核苷酸耐高温的温度真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR缓冲溶液中一般要添加Mg2+。c.PCR扩增的过程90单链50引物72由图可知,理论上通过三次循环可以得到目的基因。PCR的结果(1)合成DNA的数量:a×2n(a:初始数量;n:循环的次数)。(2)合成目的基因的数量:a×(2n-2n)。思考

PCR可以扩增mRNA吗?mRNA不可以直接扩增,需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。（3）PCR产物的鉴定：常采用

来鉴定。琼脂糖凝胶电泳知识拓展

引物的选择原则1.引物长度适宜、适量的CG含量(保证有较高的复性温度)、引物自身及引物之间不存在互补配对、引物的3'端必须和DNA模板严格互补配对,5'端不需要与DNA模板严格互补配对,5'端可以修饰。5'端修饰方法作用加入限制酶酶切位点可以利用限制酶切割产生末端,方便基因重组放射性同位素、生物素、荧光素等标记物方便扩增产物的检测增添、缺失或替换部分碱基可以产生定点突变3.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础①PCR原理：利用了

原理。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷

的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的

等有关。DNA的热变性相反大小和构象(2)PCR实验操作步骤微量移液器底部离心管(3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______的紫外灯下被检测出来。300nm针对训练6.(2022山东,13)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。

(

)7.(2022湖北,5)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。(

)8.(2022辽宁,12)PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。

(

)9.(2019江苏,10)用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热。

(

)10.(2022全国乙,38)(1)检测病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是

,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。(2)为了确保病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据病毒RNA中的

来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是

。√✕✕√逆转录酶特异性核苷酸序列复性11.(2020山东,25)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx

mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经

过程获得总cD-NA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是

。逆转录引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或:引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)12.(2019全国Ⅰ,38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是

。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是

。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的

。(2)目前在PCR中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是

。解旋酶加热至90~95℃氢键TaqDNA聚合酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活13.(2018江苏,32)(1)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的

端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是

。(2)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中

的设定与引物有关,

的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)①变性温度②复性温度③延伸温度④变性时间⑤复性时间⑥延伸时间使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连5'②

⑥

15.如图为RBD基因结构和引物位置示意图,若利用PCR扩增含有限制酶酶切位点的RBD基因时,应选择的引物为

。

14.如图,应选择引物

扩增目的基因。甲和丙引物4和引物51.目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞

或获得预期

等的基因。(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知

的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用

和序列比对工具进行筛选。性状表达产物结构和功能清晰序列数据库三、基因工程的基本操作程序2.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因

，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代启动子标记基因知识归纳

1.有时为了满足需要,会在载体中人工构建诱导型启动子,当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基因的表达。2.构建乳腺生物反应器的表达载体时,重组表达载体中需含有在乳腺中特异性表达的启动子,以便目的基因在乳腺中特异性表达,从而可在动物的乳汁中获得目的蛋白。 易混易错

启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比

启动子终止子起始密码子终止密码子位置DNADNAmRNAmRNA目的基因上游目的基因下游编码序列首端三个碱基编码序列尾端三

个碱基作用RNA聚合酶识别

和结合的部位,起

始基因的转录使转录停止翻译的起始信号(编码氨基酸:甲硫氨酸)翻译的结束信号

(不编码氨基酸)构建过程

疑难探究思考构建基因表达载体时,常使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒,该过程不使用同一

种限制酶的原因是什么?提示防止目的基因自身环化和质粒自身环化,保证目的基因与质粒正确连接。因为同种限制酶酶

切产生的末端相同,会产生正连和反连(反连时,目的基因的转录从下游到上游,导致密码子改变,不

能翻译出正确的蛋白质)的情况,增大筛选正确重组载体的工作量。正连和反连图示如下:

方法技巧

图乙结合图甲、图乙可知:最宜选用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。注:若用Ti质粒,目的基因必须插入T-DNA序列。图甲3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法、____________显微注射法

处理法受体细胞_______________________原核细胞花粉管通道法体细胞或受精卵受精卵Ca2＋转化过程将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态