细胞生物学实验课件

叶绿体的分离与荧光观察

NO.1

实验目的通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。

实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

低速离心

中速离心

高速离心

超高速离心细胞匀浆细胞核仁细胞骨架大细胞器小细胞器核糖体大分子叶绿体的分离应在等渗溶液中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。

实验用品材料新鲜菠菜。试剂0.35mol/L氯化钠溶液，

0.01%吖啶橙(acridineorange)。器材(1)主要设备:普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。(2)小型器材:烧杯,量筒,滴管,刻度离心管,纱布，无荧光载片和盖片。

实验方法一、叶绿体的分离与观察1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml0.35mol/LNaCl溶液中，装入组织捣碎机。2.低速匀浆3~5min。3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。4.每组取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。5.将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。6.将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。(1)在普通光镜下观察。(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。(3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料,加盖片后即可在荧光显微镜下观察。

实验方法二、菠菜叶手撕片观察轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/LNaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。(1)在普通光镜下观察。(2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。(3)观察其间接荧光：向所制手撕片上滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液,加盖片后即可在荧光显微镜下观察其间接荧光。

实验结果一、叶绿体的分离和观察二、菠菜叶手撕片观察

作业1.在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤镜系统，叶绿体的颜色是否有变化？2.游离叶绿体和整体细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，其颜色和强度有无差异？为什么？实验目的

1.观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；2.学习一些细胞器的超活染色技术。实验原理

2.

詹纳斯绿B1.活体染色体内活染体外活染3.中性红实验用品1.材料：人口腔上皮细胞，黄豆幼根根尖。2.试剂：Ringer溶液1/3000中性红溶液1/5000詹纳斯绿B溶液3.器材：显微镜、恒温水浴锅、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。实验方法1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察(1)取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。(2)实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。(3)在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。实验方法2.黄豆根尖细胞液泡系的超活染色与观察(1)实验前，把黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，胚根伸长到1cm以上。(2)用双面刀片把初生的小麦或黄豆幼苗根尖(约1~2cm长)小心切一纵切面，放入载玻片中内的1/3000中性红染液滴中，染色5~10min。(3)吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。(4)进行镜检。实验结果1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的光镜观察。

2.黄豆根尖细胞液泡系的光镜观察。概念：孚尔根反应是显示DNA的最典型的组织化学反应，是Feulgen和Rossenbeck在1942年首次发明出来的，简称Feulgen法。广泛用作特异显示细胞内DNA的分布。一、实验目的1.熟悉并掌握孚尔根反应的原理及其实验操作方法2.对细胞的组织化学研究方法有一初步的认识二、实验原理1.

DNA在稀HCl作用下水解，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，核糖一端的醛基被暴露。2.希夫试剂(Schiff试剂,脱色碱性品红)中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子，醌基为发色团，呈现出紫红色。

(实质：醛基与将无色品红还原为紫红色化合物）

三、实验材料、器具和药品

1.用carnoy固定液固定的鱼肝脏切片；

carnoy液：（纯酒精：冰醋酸：氯仿＝6:1:3)2.显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、香柏油，擦镜纸，盖玻片；3.Schiff试剂、1mol/L盐酸、1%亮绿、酒精、二甲苯、亚硫酸水（洗涤剂）:在200ml蒸馏水中，加入10ml1NHCl和10ml

10%偏亚硫酸氢钠水溶液（或1.0g固体）。此液在临用前配制。

四、实验步骤1、取材和固定：取材要小，一般以2-3mm的厚度为宜，固定剂通常用Carnoy溶液，固定后放4℃冰箱中4-6小时。2、脱水：依次经过95%酒精两次(每次20-30min);100%酒精两次(分别用30min、40min)。3、制片二甲苯透明，石蜡包埋，切片6-7µm，明胶贴片，烘干。在贴片时应加入1-2滴10%甲醛予以固定，否则很易脱片。4、脱蜡（本次实验开始）将制片经二甲苯Ⅰ（20min）和二甲苯Ⅱ（10min）将石蜡脱净，再经过100%，95%，85%，70%，50%，30%的酒精各8~10min,最后放入蒸馏水中5~10min。5、水解先将制片放入一盛有1mol/LHCL的染色缸中清洗，然后将载玻片放入已温浴至60℃的1mol/LHCL溶液中水解8分钟，水解后很快将标本取出，放入室温1mol/LHCL溶液中。

注意：水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，糖与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，不能呈现颜色反应。6、水洗用蒸馏水冲洗3次，使水解停止。7、染色将标本放入Schiff试剂中染色0.5~1.5小时，不可在载玻片片上直接染色。通常动物组织要染1~2小时，植物组织要染2~3小时。8、洗涤在染色缸中用亚硫酸水洗3~5次，每次洗2~3min以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料。9、水洗流水冲洗5min，再用蒸馏水洗片刻。10、复染用1%亮绿复染数秒钟

注意：时间切忌过长，以免染色过深，影响对DNA的观察。

11、水洗、脱水与封片用蒸馏水洗两次，每次5min，再经过30%，50%，70%，85%，95%，100%（Ⅰ），100%（Ⅱ）的酒精各3~5分钟；二甲苯透明Ⅰ和Ⅱ，各8~10min。中性加拿大树胶封片。12镜检五、实验结果

细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应，细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应。

-反映出DNA存在的部位

-从颜色反应的深浅，可以判断DNA的相对含量。注意：－设立对照实验：对照切片不经水解或…。分辨力(resolution)：指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用相邻两点间的距离(D)来表示。一、电子显微镜出现的必然性光源的波长镜口率(N.A.)1.分辨力可见光波长为400~700nm(平均550nm)取决于镜口角和物镜与标本间介质的折射率

波长：镜口率(N.A.)的大小：镜口角物镜与标本之间介质的折射率空气的折射率为1水为1.33香柏油为1.515

-溴萘为1.66

紫外光显微镜：0.1

m光镜分辨力的最小数值：≤0.2

m一般光镜设计的最大放大倍数为1,000~1,500

光学分辨率的极限！有效放大：指本来用肉眼看不清楚的物体经显微镜放大成像后可以分辨清楚的放大指本来用肉眼能看清楚的物体经放大镜、幻灯机或投影仪等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。无效放大：各种光与电子束的波长比较名称 波长(nm)可见光 760~390紫外光 390~13X-射线 13~0.05

-射线 1~0.005电子束

100V 0.12310,000V 0.0122100,000V 0.00387电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比：

1

V电子显微镜与光学显微镜的异同点

1,000,0001,000放大倍数0.1nm0.2~0.1

m分辨力电聚焦机械聚焦聚焦方式电磁透镜光学透镜透镜真空空气介质短：0.003~0.008长：200~750波长(nm)电子束光束照射光电子显微镜光学显微镜2.电镜与光镜的对比电子显微镜与光学显微镜结构的对比图解

二、电镜的分类根据电子束和样品之间作用方式的不同，可将电镜分为4大类:1)物体透射电子2)物体发射电子3)物体反射电子4)物体吸收电子透射电镜扫描电镜观察和分析样品的内部结构观察和分析样品的表面立体形貌三、透射式电子显微镜真空系统供电及保护系统电子照明系统成象系统观察记录系统1、透射电镜的结构电子照明系统成象系统观察记录系统真空系统供电及保护系统透镜系统或电子光学系统透射电镜的结构一般电镜超高压电镜真空系统抽真空的意义：防止灯丝的氧化损伤；确保电子束在运行过程中的运动轨迹不受空气分子干扰；去除空气分子对样品的污染。

1.3

10-12Pa离子泵真空涡流泵机械泵：油扩散泵：冷阱：真空管道、阀门、储气罐等1Pa

1.3

10-5~10-6Pa;1.3

10-6Pa

1.3

10-7~10-9Pa1.3

10-9Pa

1.3

10-10Pa真空系统的组成部件：真空系统供电及保护系统的组成部件及其作用：供电及保护系统高电压低电流的高压电源：产生高速电子低电压高电流的透镜电源：控制高速电子束的运动轨迹一般电镜均拥有两个电源：一旦电镜的某一部分发生故障,电镜的保护系统会让其自动紧急关机和断电,以免损伤电镜！稳压和稳流装置：保证电压和电流的高度稳定

保护与控制系统：电子照明系统的组成部件及其作用：电子照明系统电子枪：产生高压电子束两级聚光镜：会聚高压电子束，以得到极细而均匀的电子束流第一聚光镜：将电子束的直径缩小20~60倍第二聚光镜：将电子束的直径扩大1~2倍第二聚光镜放大第一聚光镜缩小高压(V)高压电子束灯丝栅板阳极电子枪成象系统的组成部件及其作用：成象系统样品室成像与放大装置冷阱样品放置室液氮罐金属导杆放大50倍放大3倍放大15倍放大200倍500,000倍物镜中间镜I中间镜II投影镜吸附样品室中的少量空气分子以提高真空度降低温度可防止电子的热漂移铜网样品观察记录系统的组成部件及其作用：观察记录系统注意：电镜照相与普通照相不同，图像的反衬度最低时才是正聚焦；且底片还必须要经过预干燥处理观察室放大镜照相装置透过样品的电子打到荧光屏上可显示出反映样品真实结构的图像保护眼睛荧光屏铅玻璃窗用于放大投到荧光屏上的图像电子形成的荧光图像衰减速度很快，一旦观察到理想的结构图像就需要尽快照相2、透射电镜的成像原理获得高分辨率的图像：数百万倍使用电子枪发射出了波长极短的电子波利用电磁透镜可对电子束进行聚焦、放大和成像高速电子束 透射样品电能转变成光能图像各处浓淡的不同真实反映了样品不同部位的物质结构高压电子枪高速电子束电磁透镜样品电子束发生投射荧光屏浓淡不同的图像成像原理：透射电镜照片演示微管蛋白的免疫荧光照片一个植物细胞的透射电镜照片图像各处浓淡的不同真实反映了样品中不同部位的物质结构透射电镜照片演示糙面内质网的透射电镜照片透射电镜照片演示多核糖体的透射电镜照片透射电镜照片演示玉米分散高尔基体的透射电镜照片透射电镜照片演示线粒体的透射电镜照片叶绿体的透射电镜照片透射电镜照片演示细胞核的透射电镜照片有丝分裂器的透射电镜照片凋亡细胞正在杀肿瘤细胞的T细胞透射电镜照片演示

-辅肌动蛋白热休克蛋白Hsp60笼形蛋白透射电镜照片演示金的原子布阵的透射电镜照片透射电镜照片演示T4噬菌体负染色的透射电镜照片图像各处浓淡的不同与样品中不同部位的物质结构相反透射电镜照片演示螺原体驱动蛋白核纤层蛋白纤毛动力蛋白胞质动力蛋白在透射电镜中，被观察粒子的大小一定要大于电子束的波长才能被分辨出来；否则，电子束就会发生绕射，无法看到粒子！扫描电镜透射电镜

光镜肉眼玻璃透镜(目镜)投影镜玻璃透镜(物镜)样品玻璃透镜(聚光镜)光源(卤灯或汞灯)高压电子枪样品电磁透镜束偏转器图像投到视屏上荧光屏光镜、透射电镜及扫描电镜的成像光路图解四、扫描电镜的结构与成像原理1.扫描电镜的基本结构电子光学系统电子枪电磁透镜扫描线圈样品室信号的收集处理及显示系统真空系统供电保护系统等扫描电镜电子枪电磁透镜扫描线圈样品室信号的收集处理系统真空系统供电保护系统显示系统(显象管)(1~10KV)电子枪灯丝电磁透镜探测器电磁透镜扫描线圈的束偏转器样品托样品显象管电子光学系统扫描电镜的结构简图2.扫描电镜的成像原理电子枪接受、转变成光子放大、转换成电压信号电子束电磁透镜样品表面扫描线圈次级电子信号探测器光电倍增管显象管/荧光屏样品表面上相应点所发出的次级电子数荧光点的亮度电子枪灯丝电磁透镜探测器电磁透镜扫描线圈的束偏转器样品托样品显象管次级电子扫描电镜成像原理的简单图示(1)

扫描电镜所用样品的制备方法简便(固定、干燥和喷金)，不需经过超薄切片；(2)

扫描电镜采用的是次级电子成像；(3)

扫描电镜所观察到图像景深长，图像富有立体感；(4)

图像的放大倍率在很大范围内连续可变(101~105×)；(5)

样品的辐射损伤及污染程度小等。扫描电镜在结构和工作原理上的特点：(1)

分辨率还不够高(1~10nm)；(2)

只能显示样品的表面形貌，无法显示内部详细结构。可观察到样品的内部结构；可观察到富有立体感的图像；提高了分辨率。扫描电镜的局限性：冰冻蚀刻技术(freezeetching)：利用“复膜(replica)”在透射电镜下观察：扫描电镜照片演示人耳听毛细胞的扫描电镜照片扫描电镜照片演示人RBC的扫描电镜照片有被小泡的扫描电镜照片转化细胞扫描电镜照片演示细胞褶皱的扫描电镜照片分裂沟的扫描电镜照片扫描电镜照片演示冰冻蚀刻电镜照片演示细胞质膜的冰冻蚀刻电镜照片冰冻蚀刻电镜照片演示实验目的掌握免疫细胞化学染色的基本原理和步骤；对成笼蛋白有被小泡在细胞内的形态和分布有直观认识。实验原理真核细胞中的有被小泡是参与细胞内物质运输的重要成员，按照衣被成分的不同，有被小泡可以分为成笼蛋白有被小泡、COPⅠ被小泡和COPⅡ被小泡等不同类型。免疫细胞化学是将免疫学基本原理与细胞化学技术相结合所建立起来的新技术，根据抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。免疫细胞化学染色技术在分析有机体、细胞及亚细胞水平上特定分子的定位及相互联系时是一个有力的工具，在细胞生物学研究中有着广泛的应用。它利用了抗原与抗体之间特异性结合的性质，即某种抗体仅能与刺激其产生的抗原物质结合，故当发生抗原抗体反应时，可用已知抗体去追踪和鉴定未知的抗原。一般而言，发生在固定组织或细胞内的抗原抗体反应是不可见的，但如将荧光素、酶等标记在抗体分子上，就能凭借荧光或酶与底物的颜色反应在某一部位的有无，来判断是否发生了特异的抗原抗体反应及研究抗原物质的定位。标记抗体与抗原结合方式主要有两种：①直接法；②间接法：间接法较直接法的敏感性大为增高，故应用更为广泛。间接法中较常用的有荧光标记法、过氧化物酶标记法等。本实验所用的即为辣根过氧化物酶标记的二抗，然后用DAB(3,3-二氨基联苯胺)作为辣根过氧化物酶的作用底物来显色抗原存在部位，可见棕黄色产物。

抗原第1抗体酶第2抗体底物有色产物技术原理：1.细胞培养在HeLa细胞进行传代培养时，将消毒的盖玻片条放入24孔培养板中，培养48小时后细胞密度达70-80%时，可取出盖玻片进行染色。

将长有细胞的盖玻片放入盛有PBS的小培养皿中漂洗，以洗去培养液。2.固定弃去PBS液，加入含3.7%甲醛的PBS溶液3ml，固定10分钟。用PBS洗2次，每次10分钟。实验方法3.透化吸去多余PBS，用0.5%的TritonX－100透化处理10分钟。用PBS洗2次，每次10分钟。加入含1％BSA的PBS溶液3ml，室温温育10分钟（BSA用来封闭非特异性蛋白结合位点）。4.加入一抗将盖片有细胞的一面向上，水平地放入培养皿中，加稀释好的第一抗体液（3mlPBS中加入30μl），盖好培养皿，平稳地放入37℃温箱中温育30分钟。取出盖片，放入盛有含0.1%吐温20的PBS的培养皿中室温洗2次，每次10分钟，以洗去未结合的抗体。5.加入二抗将盖片放入培养皿，加稀释好的第二抗体（3mlPBS中加入15μl），在37℃温箱中温育30分钟。取出盖片，放入盛有含0.1%吐温20的PBS的培养皿A中室温洗2次，每次10分钟。6.染色染色10分钟：3mlPBS+3滴A液+3滴B液+3滴C液。滴一滴50％甘油－PBS混合液于载玻片上，将盖片有细胞的一面向下进行封片，防止产生气泡。7.观察将制好的片子放在显微镜下观察。分辨力(resolution)：指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用相邻两点间的距离(D)来表示。一、电子显微镜出现的必然性光源的波长镜口率(N.A.)1.分辨力可见光波长为400~700nm(平均550nm)取决于镜口角和物镜与标本间介质的折射率

波长：镜口率(N.A.)的大小：镜口角物镜与标本之间介质的折射率空气的折射率为1水为1.33香柏油为1.515

-溴萘为1.66

紫外光显微镜：0.1

m光镜分辨力的最小数值：≤0.2

m一般光镜设计的最大放大倍数为1,000~1,500

光学分辨率的极限！有效放大：指本来用肉眼看不清楚的物体经显微镜放大成像后可以分辨清楚的放大指本来用肉眼能看清楚的物体经放大镜、幻灯机或投影仪等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。无效放大：各种光与电子束的波长比较名称 波长(nm)可见光 760~390紫外光 390~13X-射线 13~0.05

-射线 1~0.005电子束

100V 0.12310,000V 0.0122100,000V 0.00387电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比：

1

V电子显微镜与光学显微镜的异同点

1,000,0001,000放大倍数0.1nm0.2~0.1

m分辨力电聚焦机械聚焦聚焦方式电磁透镜光学透镜透镜真空空气介质短：0.003~0.008长：200~750波长(nm)电子束光束照射光电子显微镜光学显微镜2.电镜与光镜的对比电子显微镜与光学显微镜结构的对比图解

二、电镜的分类根据电子束和样品之间作用方式的不同，可将电镜分为4大类:1)物体透射电子2)物体发射电子3)物体反射电子4)物体吸收电子透射电镜扫描电镜观察和分析样品的内部结构观察和分析样品的表面立体形貌三、透射式电子显微镜真空系统供电及保护系统电子照明系统成像系统观察记录系统1、透射电镜的结构电子照明系统成像系统观察记录系统真空系统供电及保护系统透镜系统或电子光学系统透射电镜的结构一般电镜超高压电镜真空系统抽真空的意义：防止灯丝的氧化损伤；确保电子束在运行过程中的运动轨迹不受空气分子干扰；去除空气分子对样品的污染。

1.3

10-12Pa离子泵真空涡流泵机械泵：油扩散泵：冷阱：真空管道、阀门、储气罐等1Pa

1.3

10-5~10-6Pa;1.3

10-6Pa

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10-7~10-9Pa1.3

10-9Pa

1.3

10-10Pa真空系统的组成部件：真空系统供电及保护系统的组成部件及其作用：供电及保护系统高电压低电流的高压电源：产生高速电子低电压高电流的透镜电源：控制高速电子束的运动轨迹一般电镜均拥有两个电源：一旦电镜的某一部分发生故障,电镜的保护系统会让其自动紧急关机和断电,以免损伤电镜！稳压和稳流装置：保证电压和电流的高度稳定

保护与控制系统：电子照明系统的组成部件及其作用：电子照明系统电子枪：产生高压电子束两级聚光镜：会聚高压电子束，以得到极细而均匀的电子束流第一聚光镜：将电子束的直径缩小20~60倍第二聚光镜：将电子束的直径扩大1~2倍第二聚光镜放大第一聚光镜缩小高压(V)高压电子束灯丝栅板阳极电子枪成像系统的组成部件及其作用：成象系统样品室成像与放大装置冷阱样品放置室液氮罐金属导杆放大50倍放大3倍放大15倍放大200倍500,000倍物镜中间镜I中间镜II投影镜吸附样品室中的少量空气分子以提高真空度降低温度可防止电子的热漂移铜网样品观察记录系统的组成部件及其作用：观察记录系统注意：电镜照相与普通照相不同，图像的反衬度最低时才是正聚焦；且底片还必须要经过预干燥处理观察室放大镜照相装置透过样品的电子打到荧光屏上可显示出反映样品真实结构的图像保护眼睛荧光屏铅玻璃窗用于放大投到荧光屏上的图像电子形成的荧光图像衰减速度很快，一旦观察到理想的结构图像就需要尽快照相2、透射电镜的成像原理获得高分辨率的图像：数百万倍使用电子枪发射出了波长极短的电子波利用电磁透镜可对电子束进行聚焦、放大和成像高速电子束 透射样品电能转变成光能图像各处浓淡的不同真实反映了样品不同部位的物质结构高压电子枪高速电子束电磁透镜样品电子束发生投射荧光屏浓淡不同的图像成像原理：一个植物细胞的透射电镜照片图像各处浓淡的不同真实反映了样品中不同部位的物质结构透射电镜照片演示糙面内质网的透射电镜照片透射电镜照片演示多核糖体的透射电镜照片透射电镜照片演示线粒体的透射电镜照片叶绿体的透射电镜照片透射电镜照片演示细胞核的透射电镜照片有丝分裂器的透射电镜照片凋亡细胞正在杀肿瘤细胞的T细胞透射电镜照片演示

-辅肌动蛋白热休克蛋白Hsp60笼形蛋白透射电镜照片演示T4噬菌体负染色的透射电镜照片图像各处浓淡的不同与样品中不同部位的物质结构相反透射电镜照片演示螺原体驱动蛋白核纤层蛋白纤毛动力蛋白胞质动力蛋白在透射电镜中，被观察粒子的大小一定要大于电子束的波长才能被分辨出来；否则，电子束就会发生绕射，无法看到粒子！扫描电镜透射电镜

光镜肉眼玻璃透镜(目镜)投影镜玻璃透镜(物镜)样品玻璃透镜(聚光镜)光源(卤灯或汞灯)高压电子枪样品电磁透镜束偏转器图像投到视屏上荧光屏光镜、透射电镜及扫描电镜的成像光路图解四、扫描电镜的结构与成像原理1.扫描电镜的基本结构电子光学系统电子枪电磁透镜扫描线圈样品室信号的收集处理及显示系统真空系统供电保护系统等扫描电镜电子枪电磁透镜扫描线圈样品室信号的收集处理系统真空系统供电保护系统显示系统(显象管)(1~10KV)电子枪灯丝电磁透镜探测器电磁透镜扫描线圈的束偏转器样品托样品显象管电子光学系统扫描电镜的结构简图2.扫描电镜的成像原理电子枪接受、转变成光子放大、转换成电压信号电子束电磁透镜样品表面扫描线圈次级电子信号探测器光电倍增管显象管/荧光屏样品表面上相应点所发出的次级电子数荧光点的亮度(1)

扫描电镜所用样品的制备方法简便(固定、干燥和喷金)，不需经过超薄切片；(2)

扫描电镜采用的是次级电子成像；(3)

扫描电镜所观察到图像景深长，图像富有立体感；(4)

图像的放大倍率在很大范围内连续可变(101~105×)；(5)

样品的辐射损伤及污染程度小等。扫描电镜在结构和工作原理上的特点：扫描电镜照片演示人耳听毛细胞的扫描电镜照片扫描电镜照片演示人RBC的扫描电镜照片有被小泡的扫描电镜照片转化细胞扫描电镜照片演示细胞褶皱分裂沟扫描电镜照片演示精子细胞和卵细胞捕杀酵母细胞的吞噬白细胞(1)

分辨率还不够高(1~10nm)；(2)

只能显示样品的表面形貌，无法显示内部详细结构。可观察到样品的内部结构；可观察到富有立体感的图像；提高了分辨率。扫描电镜的局限性：冰冻蚀刻技术(freezeetching)：利用“复膜(replica)”在透射电镜下观察：冰冻蚀刻电镜照片演示细胞质膜的冰冻蚀刻电镜照片冰冻蚀刻电镜照片演示分辨力(resolution)：指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用相邻两点间的距离(D)来表示。一、电子显微镜出现的必然性光源的波长镜口率(N.A.)1.分辨力可见光波长为400~700nm(平均550nm)取决于镜口角和物镜与标本间介质的折射率

波长：镜口率(N.A.)的大小：镜口角物镜与标本之间介质的折射率空气的折射率为1水为1.33香柏油为1.515

-溴萘为1.66

紫外光显微镜：0.1

m光镜分辨力的最小数值：≤0.2

m一般光镜设计的最大放大倍数为1,000~1,500

光学分辨率的极限！有效放大：指本来用肉眼看不清楚的物体经显微镜放大成像后可以分辨清楚的放大指本来用肉眼能看清楚的物体经放大镜、幻灯机或投影仪等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。无效放大：各种光与电子束的波长比较名称 波长(nm)可见光 760~390紫外光 390~13X-射线 13~0.05

-射线 1~0.005电子束

100V 0.12310,000V 0.0122100,000V 0.00387电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比：

1

V电子显微镜与光学显微镜的异同点

1,000,0001,000放大倍数0.1nm0.2~0.1

m分辨力电聚焦机械聚焦聚焦方式电磁透镜光学透镜透镜真空空气介质短：0.003~0.008长：200~750波长(nm)电子束光束照射光电子显微镜光学显微镜2.电镜与光镜的对比电子显微镜与光学显微镜结构的对比图解

二、电镜的分类根据电子束和样品之间作用方式的不同，可将电镜分为4大类:1)物体透射电子2)物体发射电子3)物体反射电子4)物体吸收电子透射电镜扫描电镜观察和分析样品的内部结构观察和分析样品的表面立体形貌三、透射式电子显微镜真空系统供电及保护系统电子照明系统成象系统观察记录系统1、透射电镜的结构电子照明系统成象系统观察记录系统真空系统供电及保护系统透镜系统或电子光学系统透射电镜的结构一般电镜超高压电镜真空系统抽真空的意义：防止灯丝的氧化损伤；确保电子束在运行过程中的运动轨迹不受空气分子干扰；去除空气分子对样品的污染。

1.3

10-12Pa离子泵真空涡流泵机械泵：油扩散泵：冷阱：真空管道、阀门、储气罐等1Pa

1.3

10-5~10-6Pa;1.3

10-6Pa

1.3

10-7~10-9Pa1.3

10-9Pa

1.3

10-10Pa真空系统的组成部件：真空系统供电及保护系统的组成部件及其作用：供电及保护系统高电压低电流的高压电源：产生高速电子低电压高电流的透镜电源：控制高速电子束的运动轨迹一般电镜均拥有两个电源：一旦电镜的某一部分发生故障,电镜的保护系统会让其自动紧急关机和断电,以免损伤电镜！稳压和稳流装置：保证电压和电流的高度稳定

保护与控制系统：电子照明系统的组成部件及其作用：电子照明系统电子枪：产生高压电子束两级聚光镜：会聚高压电子束，以得到极细而均匀的电子束流第一聚光镜：将电子束的直径缩小20~60倍第二聚光镜：将电子束的直径扩大1~2倍第二聚光镜放大第一聚光镜缩小高压(V)高压电子束灯丝栅板阳极电子枪成象系统的组成部件及其作用：成象系统样品室成像与放大装置冷阱样品放置室液氮罐金属导杆放大50倍放大3倍放大15倍放大200倍500,000倍物镜中间镜I中间镜II投影镜吸附样品室中的少量空气分子以提高真空度降低温度可防止电子的热漂移铜网样品观察记录系统的组成部件及其作用：观察记录系统注意：电镜照相与普通照相不同，图像的反衬度最低时才是正聚焦；且底片还必须要经过预干燥处理观察室放大镜照相装置透过样品的电子打到荧光屏上可显示出反映样品真实结构的图像保护眼睛荧光屏铅玻璃窗用于放大投到荧光屏上的图像电子形成的荧光图像衰减速度很快，一旦观察到理想的结构图像就需要尽快照相2、透射电镜的成像原理获得高分辨率的图像：数百万倍使用电子枪发射出了波长极短的电子波利用电磁透镜可对电子束进行聚焦、放大和成像高速电子束 透射样品电能转变成光能图像各处浓淡的不同真实反映了样品不同部位的物质结构高压电子枪高速电子束电磁透镜样品电子束发生投射荧光屏浓淡不同的图像成像原理：透射电镜照片演示微管蛋白的免疫荧光照片一个植物细胞的透射电镜照片图像各处浓淡的不同真实反映了样品中不同部位的物质结构透射电镜照片演示糙面内质网的透射电镜照片透射电镜照片演示多核糖体的透射电镜照片透射电镜照片演示玉米分散高尔基体的透射电镜照片透射电镜照片演示线粒体的透射电镜照片叶绿体的透射电镜照片透射电镜照片演示细胞核的透射电镜照片有丝分裂器的透射电镜照片凋亡细胞正在杀肿瘤细胞的T细胞透射电镜照片演示

-辅肌动蛋白热休克蛋白Hsp60笼形蛋白透射电镜照片演示金的原子布阵的透射电镜照片透射电镜照片演示T4噬菌体负染色的透射电镜照片图像各处浓淡的不同与样品中不同部位的物质结构相反透射电镜照片演示螺原体驱动蛋白核纤层蛋白纤毛动力蛋白胞质动力蛋白在透射电镜中，被观察粒子的大小一定要大于电子束的波长才能被分辨出来；否则，电子束就会发生绕射，无法看到粒子！扫描电镜透射电镜

光镜肉眼玻璃透镜(目镜)投影镜玻璃透镜(物镜)样品玻璃透镜(聚光镜)光源(卤灯或汞灯)高压电子枪样品电磁透镜束偏转器图像投到视屏上荧光屏光镜、透射电镜及扫描电镜的成像光路图解四、扫描电镜的结构与成像原理1.扫描电镜的基本结构电子光学系统电子枪电磁透镜扫描线圈样品室信号的收集处理及显示系统真空系统供电保护系统等扫描电镜电子枪电磁透镜扫描线圈样品室信号的收集处理系统真空系统供电保护系统显示系统(显象管)(1~10KV)电子枪灯丝电磁透镜探测器电磁透镜扫描线圈的束偏转器样品托样品显象管电子光学系统扫描电镜的结构简图2.扫描电镜的成像原理电子枪接受、转变成光子放大、转换成电压信号电子束电磁透镜样品表面扫描线圈次级电子信号探测器光电倍增管显象管/荧光屏样品表面上相应点所发出的次级电子数荧光点的亮度电子枪灯丝电磁透镜探测器电磁透镜扫描线圈的束偏转器样品托样品显象管次级电子扫描电镜成像原理的简单图示(1)

扫描电镜所用样品的制备方法简便(固定、干燥和喷金)，不需经过超薄切片；(2)

扫描电镜采用的是次级电子成像；(3)

扫描电镜所观察到图像景深长，图像富有立体感；(4)

图像的放大倍率在很大范围内连续可变(101~105×)；(5)

样品的辐射损伤及污染程度小等。扫描电镜在结构和工作原理上的特点：(1)

分辨率还不够高(1~10nm)；(2)

只能显示样品的表面形貌，无法显示内部详细结构。可观察到样品的内部结构；可观察到富有立体感的图像；提高了分辨率。扫描电镜的局限性：冰冻蚀刻技术(freezeetching)：利用“复膜(replica)”在透射电镜下观察：扫描电镜照片演示人耳听毛细胞的扫描电镜照片扫描电镜照片演示人RBC的扫描电镜照片有被小泡的扫描电镜照片转化细胞扫描电镜照片演示细胞褶皱的扫描电镜照片分裂沟的扫描电镜照片扫描电镜照片演示冰冻蚀刻技术冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。(freeze-etchingtechniques)亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。①将标本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低温冰冻。

②然后用冰刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构——蚀刻(etching)。蚀刻断裂(2)冰冻蚀刻技术的操作步骤:

③蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。复膜④复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。细胞质膜的冰冻蚀刻电镜照片冰冻蚀刻电镜照片演示实验目的：掌握植物细胞骨架处理及染色方法。实验原理：用适当浓度的TritonX-100处理时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮蓝R250染色，可在光学显微镜下观察到细胞骨架的网状结构。实验试剂：1、M-缓冲液；2、pH6.8磷酸缓冲液；3、1%TritonX-100，用M-缓冲液配制；4、0.2%考马斯亮兰R250；5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸缓冲液配制；实验步骤：撕取洋葱鳞茎内表皮细胞约1cm2大小若干片，置于培养皿中，加入pH6.8磷酸缓冲液,没过表皮即可，放置约1-2min；吸去pH6.8磷酸缓冲液，用1%TritonX-100处理30min；吸去1%TritonX-100，用M-缓冲液洗3次，每次3min；3%戊二醛固定30min；pH6.8磷酸缓冲液洗3次，每次3min；0.2%考马斯亮蓝R250染色10min；用蒸馏水洗1-2次，将内表皮细胞平铺于载玻片上，加盖玻片，于显微镜下观察。实验结果一实验目的1．通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理与方法；2．观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。二实验原理采用差速离心分离细胞器：在等渗介质中，组织匀浆液在不同的离心力和离心时间下，细胞器按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。菠菜组织匀浆液在0.35mol.L-1氯化钠溶液以3000r.min-1下离心5分钟，沉淀即为叶绿体和部分细胞核；叶绿体具有荧光现象，可利用荧光显微镜观察。菠菜叶富含叶绿体，可采用徒手切片观察其形态和分布；三、实验用品1．器材离心机、组织捣碎机、普通及荧光显微镜、天平、离心管、纱布、烧杯、量筒、滴管、载玻片、盖玻片2．材料新鲜菠菜叶3．试剂0.35mol/L氯化钠溶液四、实验方法（一）叶绿体的分离与观察取新嫩菠菜叶，洗净檫干、去梗，称30g，分批放入匀浆器。加入0.35mol/L氯化钠溶液，共150ml，5000r.min-1匀浆，制成匀浆；将匀浆用６层纱布过滤于烧杯中；取滤液４ml在1000r/min离心２min，取上清；上清液3000r/min离心５min．去上清，沉淀即为叶绿体；加0.35mol/L氯化钠溶液悬浮沉淀；取叶绿体悬液１滴于载玻片上，加盖片：普通光镜下观察；荧光显微镜下演示（二）菠菜叶徒手切片观察新嫩菠菜叶斜切面１片，0.35mol/L氯化钠溶液１滴；加盖片轻压：光镜下观察叶绿体在表皮细胞和保卫细胞中的分布；荧光显微镜下演示。五实验结果与分析1．简述：叶绿体的分离原理和方法；2．绘图：菠菜叶肉细胞的形态，显示叶绿体。实验二线粒体和液泡系的超活染色观察一、实验目的1．观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量和分布；2．了解一些细胞器的超活染色技术

二、实验原理詹纳斯绿Ｂ可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色。

中性红对液泡系的染色具有专一性，将活细胞中的液泡系染成红色。

三、实验用品1．器材：显微镜、恒温水浴锅、、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸2．试剂：Ringer液：氯化钠8.5g（变温动物用6.5g）氯化钙0.12g碳酸氢钠0.20g氯化钾0.14g磷酸氢二钠0.01g葡萄糖2.0g加蒸馏水至1000ml1/5000詹纳斯绿Ｂ1/3000中性红3．材料：人口腔上皮细胞、黄豆幼根根尖四、实验方法（一）口腔上皮细胞线粒体的超活染色与观察载玻片置于37℃

恒温水浴锅上，滴1/5000詹纳斯绿Ｂ1-2滴；牙签宽头取口腔上皮细胞，放入载玻片的染液滴上，于３７℃恒温染色10-15min，显微镜下观察．

（二）绿豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察实验前使黄豆种子发芽，芽长1cm以上；初生豆苗根尖（１－２cm）纵切面切片，1/3000中性红溶液１滴染色5-10min，载玻片于37℃恒温水浴，盖上盖玻片压扁根尖，显微镜下观察．五、作业1．绘出人口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布并简要分析。2．绘出黄豆幼根根尖组织液泡系的形态与分布并简要分析。实验三孚尔根反应一实验目的熟悉并掌握孚尔根反应的原理及其实验操作方法对细胞的免疫组织化学研究方法有初步的认识二实验原理DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。DNA经1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。三实验仪器及材料实验仪器：显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。实验材料：洋葱鳞茎或根尖

四实验步骤对照片：方法一先将材料放在5%三氯醋酸中90℃水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后其它方法同上。•方法二材料不经1NHCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤④－⑦制片观察。五作业1.简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。2.绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。3.描述你的对照实验结果。实验四染色体核型分析核型（karyotype）:指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。正常细胞的核型能代表个体的核型。组型（idiogram）是以模式图的方式表示，它是通过对许多细胞染色体的测量取其平均值绘制而成的，是理想的，模式化的染色体组成。代表了一物种染色体组型的特征。核型的研究对人类医学遗传研究及临床应用，对探讨动植物起源、物种间亲缘关系，鉴定远缘杂种等方面都有重大意义。

一实验原理染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。重要的参数有三个：

相对长度（relativelength）:指单个染色体长度与包括Ｘ（或Ｙ）染色体在内的单倍染色体总长之比，以百分率表示。臂指数（amindex）：指长臂同短臂的比率着丝粒指数（centromereindex）:指短臂占该染色体长度的比率，它决定着丝粒的相对位置。人类体细胞的正常核型是含有46条染色体，相互构成23对。其中22对是男女所共有的常染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY，女XX。根据丹佛（1960）、伦敦（1963）和芝加哥（1966）会议提出的标准，即按照染色体的长度依次减小和着丝粒位置以及其它特征，把人类体细胞染色体分为七个组群。二实验仪器及试材（一）仪器、用具：摄影显微镜、胶卷、冲印放大器材、剪刀、镊子、毫米尺、胶水（二）材料人类体细胞染色体标本三实验步骤1．在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姊妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄。2．将显微拍摄放大好的照片上的一个细胞的全部染色体，分别一条一条剪下。3．根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的目测配对。4．测量出每条染色体短臂和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数，并记录原始数据。5．根据测量数据校正目测配对排列的结果，进行调整排列。6.把染色体按一定顺序一对一对地排列，排列时注意短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列，最后把染色体贴成一完整的染色体组型图。7．翻拍。四作业根据染色体照片，进行染色体组型分析

实验五PEG介导的细胞融合

实验一实验目的1.通过PEG介导的鸡血细胞融合实验,

对体细胞融合有一个清楚的概念

2.并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术

二实验原理一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,

使两细胞的胞质沟通,

从而造成相互接触的细胞之间发生融合。

其融合效果受以下几种因素的影响：1.

PEG的分子量与浓度:

细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,

对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2.

PEG的pH值:

PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3.

PEG的处理时间:

处理时间越长，融合效果越好,

但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养,

故处理时间可适当放宽至数分钟。4.

融合时的温度:

由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果,

在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细,

一般采用的温度为38~40℃。

本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为:

1.

鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2.

实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。三实验用品1器材

主要设备:

普通离心机、普通光学显微镜

小型器材:

100ml量筒2个,

滴管10支,

10ml刻度离心管20支,

载、盖片各20片

材料

：新鲜鸡血

2试剂

（1）

Alsever液制备

：葡萄糖

2.05g

、枸椽酸钠

0.8g

、氯化钠0.42g

、重蒸水

100ml

（2）

0.85%生理盐水液

（3）

GKN液

：氯化钠

8g

、氯化钾

0.4g、葡萄糖

2g

、

Na2HPO4•2H2O

1.77g、NaH2PO4•H2O

0.69g

、酚红

0.01g

、1000ml重蒸水中。

（4）

50%

PEG液

(现用现配)

称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀。

四实验步骤将Alsever液与活鸡翼下鸡血混成1:4悬液

（抗凝效果最佳）

↓

4。冰箱保存

↓

取上述悬液加入生理盐水混匀

↓

1200r/min离心5分钟

↓弃上清（上述离心速率重复离心两次(5min,

10min)

（以达到去除细胞表面粘附物质的目的）

加入适量GKN液，配成细胞悬液

↓

取悬液以血球计数法计数

↓

再用GKN液将红细胞的浓度稀释

↓

加入

50%的PEG液混匀

↓

吸取1~2滴镜检并计算出融合率

五实

验

结

果

经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。

细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。可用如下公式表示：

融合率=视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总和数*100%

在实验中统计融合率时,

要进行多个视野计数，然后再加以平均，以使计算更为准确。

六作业1.PEG法诱导细胞融合的影响因素有哪些？2.本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞？为什么？3.本实验的材料为什么不用兔子或小鼠的血细胞？如果因实验需要必需选用小鼠血细胞作为实验材料，应如何对融合细胞进行鉴别？请你根据目前所掌握的知识谈谈你所能设想到的鉴别方法。实验六动物细胞微丝束的光学显微镜观察一实验目的掌握考马斯亮蓝R250染动物细胞胞质微丝的方法对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识二实验原理考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，可以使各种细胞骨架蛋白着色，并特异性地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，以及有些纤维太细，在光镜下无法分辨，因此，本实验可以看到的是微丝组成直径为40nm的张力纤维，张力纤维形态长而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞。染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+，在低Ca条件下，骨架纤维保持聚合状态并较为舒张。三实验用品材料：体外培养的动物细胞试剂：

0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）０.２ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢ磷酸缓冲液（ｐＨ＝７.３）Ｍ－缓冲液１％的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／Ｍ－缓冲液０.２％的考马斯亮蓝Ｒ250３０％的戊二醛－ＰＢ溶液器材：显微镜，载玻片，３５ｍｍ小染缸。一、实验目的

1．观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量和分布；2．了解一些细胞器的超活染色技术

二、实验原理

活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致引起细胞的死亡。根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常将活体染色分为体内活染和体外活染两类。二、实验原理体外活染又称超活染色。它是由活的动、植物细胞分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某些结构上而显色。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂。应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用。本实验采用詹纳斯绿B和中性红两种碱性染料。二、实验原理詹纳斯绿Ｂ可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基（即无色状态）。中性红对液泡系的染色具有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色。细胞核与细胞质完全不着色。三、实验用品

1．器材：显微镜、恒温水浴锅、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸2．试剂：a）Ringer液：

氯化钠8.5g（变温动物用6.5g）

氯化钙0.12g

碳酸氢钠0.20g

氯化钾0.14g

磷酸氢二钠0.01g

葡萄糖2.0g

加蒸馏水至1000mlb）1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液c）1/3000中性红溶液3．材料：人口腔上皮细胞、黄豆幼根根尖四、实验方法

（一）口腔上皮细胞线粒体的超活染色与观察（1）取清洁载玻片置于37℃恒温水浴锅上，滴1-2滴1/5000詹纳斯绿Ｂ染液；（2）用牙签宽头取口腔上皮细胞，将刮下的黏液状物放入载玻片的染液滴上，在37℃恒温染色10-15min，显微镜下观察。（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液）口腔上皮细胞线粒体四、实验方法

（二）黄豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察1）实验前，把黄豆种子培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，芽伸长到1cm以上；2）用刀片把初生豆苗根尖（1-2cm）切一纵切面，滴一滴1/3000中性红溶液染色5-10min；载玻片于37℃恒温水浴中。3）吸去染液，盖上盖玻片，压扁根尖，显微镜下观察。黄豆幼根根尖液泡系接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞.一、杂交瘤技术产生的3个技术关键1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞(Blymphocytes)：骨髓瘤细胞(myelomacells):恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。2.细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命Köhler和Milstein,19751984年Nobel医学奖3.杂交瘤细胞的筛选：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/

脾细胞骨髓瘤细胞/

骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活HAT培养基筛选H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)

谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途径(旁路途径)二、杂交瘤技术的操作流程1.动物免疫：目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.特定目标抗原动物免疫脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法常用免疫方法：“稳妥；优势克隆”皮下注射腹腔注射静脉注射免疫途径：“省时；省抗原”“省时”“操作繁琐”常规免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂第3次免疫：抗原+不加佐剂第4次免疫：抗原+不加佐剂(皮下注射或静脉注射)(皮下注射)(皮下注射)(静脉注射)二、细胞融合及HAT筛选病毒介导的细胞融合PEG介导细胞融合电激融合1、细胞融合方法：细胞悬液的制备与融合(1)脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备

(2)骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备(3)细胞融合：50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1min2、HAT培养基的筛选融合后细胞混合液HAT培养基2weekslaterHT培养基正常培养基1weeklater三、抗体的检测要求：

简便、快速、敏感;

在短时间内能检测大量样品常用方法：酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)双相扩散法酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：四、克隆化常用克隆化方法：有限稀释法软琼脂平板法显微操作法80个细胞/96孔饲养细胞(feedercells)ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇——单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)单克隆抗体优点：

高度纯一高度专一应用：疾病的论断和治疗(生物导弹)生物大分子的鉴定、定位和分离纯化细胞器的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离五、大规模培养——批量生产单克隆抗体常用的大规模培养方法：动物接种法转瓶培养法细胞培养罐法培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体动物免疫细胞融合混合细胞的HAT筛选)分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天后细胞死亡无限生长细胞分泌X抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c杂交瘤技术操作流程图解定义：转基因动物（transgenicanimal）

是指染色体基因组中整合有外源基因并能表达和稳定遗传的一类动物。转基因动物培育的原理转基因动物培育的方法与关键技术实验录像中的内容转基因动物的发展史讲授提纲转基因动物的发展史

1974年，Jaenish和Mintz应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40DNA转基因小鼠。

1980年，Gordon等人首先育成带有人胸苷激酶基因的转基因小鼠。1982年Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得比普通小鼠生长速度快2~4倍，体形大一倍的转基因“硕鼠”后，转基因动物技术轰动了整个生命科学界转基因动物的发展史

目前，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域，并取得了许多有价值的研究成果。转基因动物的发展史转基因动物培育的原理转基因动物培育的方法与关键技术实验录像中的内容转基因动物的发展史讲授提纲

借助分子生物学和胚胎工程的技术，将外源目的基因在体外扩增和加工，导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后，发育成携带有外源基因的转基因动物。转基因动物培育的原理转基因动物培育的原理转基因动物培育的方法与关键技术实验录像中的内容转基因动物的发展史讲授提纲转基因动物培育的方法逆转录病毒感染法；胚胎干细胞介导法；精子载体导入法；基因显微注射法等。基因显微注射法基因显微注射法流程图（1）目的基因的制备与纯化

（2）卵供体母鼠和假孕母鼠的准备

（3）超排卵与取卵

（4）基因显微注射

（5）受精卵移植

（6）目的基因的表达整合鉴定和检测

（7）建系转基因小鼠的培育程序（1）目的基因的制备与纯化

制备：①通过限制性内切酶预先分离