2024粮油检验油脂定性试验

2-的测定PAGEPAGE1动植物油脂甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定范围本文件描述了动植物油脂的甘三酯分子2-位脂肪酸（β或内位）组分的测定方法。本方法适用于熔点低于50℃在酯交换反应开始后10分钟内在50℃的反应混合物中变成液体的油脂。本方法不适于含有下列组分的油脂：——含有少于四个碳原子的脂肪酸；——含有多于二十二个碳原子的脂肪酸；——含有羟基脂肪酸（如：蓖麻油酸）。规范性引用文件（包括所有的修改单）适用于本文件。GB5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定GB5009.229食品安全国家标准食品中酸价的测定GB/T5524动植物油脂扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T15687动植物油脂试样的制备术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。原理试样中游离脂肪酸中和后，经柱层析净化，用酶将甘三酯水解成2-单甘酯，经薄层层析（TLC）分离，用气相色谱测定脂肪酸组分含量。试剂所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682要求的二级水。用于试样净化的试剂2-丙醇或乙醇：95%（体积分数）。30℃-60℃。2-丙醇：50%（体积分数）或乙醇：50%（体积分数）。氢氧化钠溶液：0.5mol/L。酚酞溶液：1g100mL95%（体积分数）乙醇中。260℃2hⅠ级，保存在干燥器中。氮气。用于甘三酯水解的试剂3Å72700mg/L。固定化南极假丝酵母脂肪酶（CAL-B）Moesziomycesantarctica（Candidaantarctica，Pseudozymaantarctica）。储存在干燥的冰箱里。注1：商品化的CAL-B包括：Novozym435（丹麦诺维信），IM-NE100(无锡蔚蓝生物），LipaseCL‘Amano’IM（日本天野），CHIRAZYMEL-2C4（瑞士罗氏诊断）或其他同等的CAL-B脂肪酶。注2：PLU（PropylLaurateUnit）是月桂酸丙酯单位，对应于规定的标准条件下1分钟内产生1µmol月桂酸丙酯所需的酶活性的量。注3：脂肪酶制剂的活性浓度由制造商说明。2-单甘酯的试剂乙醇：95%（体积分数）。30℃-60℃。丙酮。硅胶：含有粘合剂，用于薄层层析。展开剂：正己烷或石油醚+乙醚+98%甲酸=70+30+1。显示剂：2’,7’-二氯荧光黄乙醇溶液（2’,7’-Dichlorofluorescein）：2g/L。100mL1滴1mol/L氢氧化钠溶液使呈微碱性。2-单甘酯的试剂参见GB5009.168-2016的第3章。仪器用于试样净化的仪器30℃-40℃之间能恒温控制。13mm400mm250mL氮吹仪：提供氮气流。分液漏斗：500mL。圆底烧瓶：100mL。用于甘三酯水解的仪器玻璃离心管：10mL，带有磨口玻璃塞。30-50℃±0.5℃150-180/振荡。30-50℃±0.5℃。150–180/分速度搅拌。150-180/分速度搅拌。16-40μm。秒表。2-单甘酯的仪器200mm×200mm涂布器：用于制备薄层层析板。玻璃板：200mm×200mm。微量注射器：3μL/滴-4μL/滴。喷雾器：用于薄层层析板喷射显示剂。微型刮铲：用于刮下薄层层析板上单甘酯谱带。6.3.7 103℃±2℃。254nm。圆底烧瓶：25mL，1m锥形瓶：250mL，带有磨口玻璃塞。锥形瓶：50mL。干燥器：内有有效的干燥剂。2-单甘酯的仪器参见GB5009.168-2016的第4章。扦样按照GB/T5524执行。试样制备按GB/T15687制备试样。操作步骤试样酸价的测定按GB5009.229测定试样酸价。如果酸价不高于1.5mg/g，可按9.3直接通过氧化铝层析柱净化试样；如果酸价高于1.5mg/g，先按9.2在有溶剂存在的情况下用氢氧化钠中和，然后按9.3氧化铝层析柱净化试样。氢氧化钠中和将约10g的油样溶解于100mL（6.1.5）50mL2-丙醇或乙醇（5.1.1），几滴酚酞溶液（5.1.5），加入中和油样游离脂肪酸所需的氢氧化钠溶液（5.1.4）并超量0.5%50mL（粘液和不溶于水的物质）25mL-30mL的2-清洗中和油脂的正己烷或石油醚，直至酚酞的粉红色消失为止。将溶液转移到旋转蒸发器（6.1.3）的底瓶中，在减压条件下去除大部分正己烷或石油醚。减压并通入氮气流（5.1.7）、在30℃-40℃温度下干燥油脂，直到溶剂完全除去为止。氧化铝层析柱净化试样15g已活化的氧化铝（5.1.6）与50mL正己烷或石油醚（5.1.2）制备成悬浮液，边振动边倒入层析1mm-2mm25mL油醚（5.1.2）溶解的5g油脂溶液，小心地倒入层析柱里，用100mL圆底烧瓶（6.1.6）收集从层析柱流出的洗涤液。水解甘三酯0.1g1.0g（5.2.1）（6.2.1）40-50℃的水浴锅中，直到变为液体。440PLUCAL-B(5.2.2)，盖上塞子，30℃150-180/3±3分钟。也可以在恒温水浴锅中（6.2.3），采用磁性搅拌棒（6.2.4）或磁性搅拌盘（6.2.5）搅拌，搅150/30℃3±3注：在起草本标准时，440PLU固定化CAL-B相当于44mgNovozym435，44mgIM-NE100或72mgCHIRAZYMEL-2C4，或38mg脂肪酶CL'Amano'IM。中除去。反应混合物可在-20℃保存至分析。4400（PLU）的固定CAL-B脂肪酶(5.2.2)，同时确保在后续分离2-单甘酯和制备脂肪酸甲酯有足够的样品用于分析。2-单甘酯薄层板的制备用乙醇、正己烷或石油醚（5.3.2）和丙酮（5.3.3）小心清洗玻璃板为避免酰基转移，硅胶板可用硼酸饱和处理。反应混合物应尽快进行薄板层析分离。外，事先把制备的薄层板放在展开槽中，用溶剂展开到薄层板的顶端加以清洗。2-单甘酯的分离用微量注射器（6.3.4）将试样提取液（9.4.5）滴在距薄层板（9.5.1）底边15mm的位置，使细滴组成连续带。将薄层板放入展开槽（6.3.1），展开槽事先加有展开剂（5.3.5），并已达到饱和状态。盖上盖子进行层析（层析温度约2010mm处为止。在约20℃温度的空气中干燥薄层板，用喷雾器（6.3.5）将显示剂（5.3.6）喷涂在薄层板上。在紫外光灯（6.3.8）下标出单甘酯的谱带（Rf值约0.035），用微型刮铲（6.3.6）刮下，要避免刮到起点线上的物质。在室温下是液体的净化试样（9.3），收集的硅胶移入烧瓶（6.3.9），按9.6步骤进行操作。在室温下是固体的净化试样（9.3），收集到的硅胶移入50mL锥形瓶（6.3.11），加15mL乙醚（5.2.1），充分摇动。把所有硅胶移入烧结玻璃过滤器（6.2.6），每次用15mL乙醚（5.2.1）冲洗过滤器（6.2.6），共三次。收集过滤液用旋转蒸发器（6.1.2）除去乙醚至滤液体积为4mL-5mL，将其转（5.1.7）甘酯的量应占该试样量的10g/100g-30g/100g，否则要重新水解甘三酯（9.3）。2-单甘酯收集硅胶所获得的单甘酯（或从硅胶中提取的单甘酯），按GB5009.168-2016的5.2.1.4制备脂肪酸甲酯。再按GB5009.168测定脂肪酸甲酯。结果表示计算出各种2-单甘酯占总2-单甘酯的比值，以质量分数表示。结果保留一位小数。精