电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中的应用样本

电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中应用前言质谱作为一种分析办法，长期以来始终用于小分子化合物构造分析。直到80年代末电喷雾电离质谱（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）和基体辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS）两种“软电离（softionization）”质谱浮现，才将质谱分析范畴扩大到生物大分子构造分析。在生物界，生物分子非共价特殊作用是分子辨认基本。因而，非共价复合物检查在生物学上是一种重要研究课题。虽然MALDI-TOF较高敏捷度和Mr表征范畴对于测定生物大分子物质优于ESI质谱，但是它在检测非共价复合物应用上却受到供试品制备条件限制[1]刘益华，徐俊福.基质辅助激光解吸飞行时间质谱在生物大分子中应用.中华人民共和国生化药物杂志.，25(3)：192-193。而ESI-MS对蛋白质复合物研究在样品用量少、迅速状况下可得到可靠数据和较多信息。由于其具备敏捷度高、迅速和质量精准度高长处，复合物化学计量比可以很容易地推导出。通过变化源锥孔（cone）电压、变化溶液pH值和进样毛细管温度，可以比较不同化合物与蛋白质亲合力大小[2]ParmanikBN，BartnerPL，MirzaUA，etal.Electrosprayionizationmassspectrometryforthestudyofnon-covalentcomplexes：anemergingtechnology[J].JMassSpectrom,1998，33(10):911-920。对非共价键复合物进行某些酶解或完全酶解，还可以拟定小分子与蛋白质结合位点[3]MillarAL，NicholasAC，JacksonNAC，etal.Rapidanalysisofepitope-paratopeinteractionsbetweenHIV-1anda17-amino-acidneutralizingmicroantibodybyelectrosprayionizationmassspectrometry[J].EurJBiochem,1998,258(1):164-169.。可见，ESI-MS可广泛用于研究蛋白质非共价键复合物。到当前为止，用ESI-MS观测到不同非共价键复合物涉及蛋白质-蛋白质［4］OgorzaleklooRR，GoodlettDR，SmithRD，etal.ObservationofanoncovalentribonucleaseS-proteinS-peptidecomplexbyelectrosprayionizationmassspectrometry[J]，JAMChemSoc,1993,115(10):4391-4392，蛋白质-配体［5］RobinsonCV，ChungEW，KragelendBB，etal.Probingthenatureofnoncovalentinteractionbymassspectrometry.Astudyofprotein-CoAligandbindingandassembly[J].JAmChemSoc,1996,118(36):8646-8653，蛋白质-寡核苷酸［6］Light-WahlKJ，SpringerDL，WingerBE，etal.Observationofasmalloligonucleotideduplexbyelectrosprayionizationmassspectrometry[J].JAmChemSoc，1993,115(2):803-804.和蛋白质-双链DNA［7］ChengXH，MorinPE，HarmsAC，etal.Massspectrometrycharacterizationofsequence-specificcomplexesofDNAandtranscriptionfactorPU.1DNAbindingdomain[J].Analbiochem,1996,239(1):35-40.及蛋白质-金属离子等［8］HuP，LooJA.Gas-phasecoordinationpropertiesofZn2+,Cu2+,Ni2+，andCo2+withhistidine-containingpeptides[J].JAMChemSoc,1995,117(45):11314-11319.。电喷雾质谱（ESI-MS）基本原理及特点其原理是[9,10]岳贵花，许崇峰，卞利萍等.电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中应用.分析化学学报,,16(6):495-502.王红霞，杨松成.蛋白质非共价复合物电喷雾质谱研究进展.药学学报,,36(4):315-320.:在高压电场下，少量液体在雾化气作用下形成溶剂化离子飞向电极，在这一过程中，受外界条件作用（如逆向干燥气流），逐渐脱溶剂化以致最后溶质离子从该溶剂化离子中解吸出来形成带多电荷分子离子进入质谱。电喷雾电离特点是蛋白质等生物分子能产生多电荷离子，使质荷比减少到多数质谱仪都可以检测范畴，因而大大扩大了分子量分析范畴。分析物离子真实分子量可以依照质荷比及所带电荷数计算，普通由计算机软件完毕。电喷雾质谱可充许有少量盐和缓冲液，但盐和缓冲液存在会使仪器敏捷度减少。电喷雾质谱长处是可以以便地与各种分离技术联用，如液质联用和毛细管电泳－质谱联用等。喷雾质谱（ESI-MS）在蛋白质非共价键复合物研究应用自1991年Ganem[11]GanemB，LIYT，HenionJD.Detctionnoncovalentreceptor-ligandcomplexesbymassspectrometry[J].JAmChemSoc，1991,113(16):6249-6296.等最早应用电喷雾质谱研究细胞浆中受体蛋白FKBP12及其配体FK506和rapamycin非共价键复合物以来，该技术被越来越多学者所应用。关于蛋白质－配体－以及构成蛋白质各亚基间非共价互相作用文献报道诸多，Joseph[12]JosephALoo.MassSpectrom.Review[J],1997,16:1.列出了近年来ESIMS在这一领域研究进展。3.1蛋白质－蛋白质互相作用诸多蛋白质在体内实验中互相作用很强，而相似蛋白质寡聚体或其她形成功能蛋白复合体互相作用很弱。ESI-MS也允许以通过质量测定对蛋白质－蛋白质复合体构造供应直接、明确信息。与其她光谱技术相比，这种技术有诸多优势，例如，测定余因子依赖蛋白质-蛋白质互相作用[84]。4-草酸丁烯酸酯异构体酶四级构造是第一次采用ESI-MS进行分析寡聚蛋白[86]。依照分子筛色谱和超速离心，以为4-草酸丁烯酸酯异构体酶为五倍体[87]。X－射线衍射和质谱明确显示此蛋白质为一种41kDa六倍体(86,88)。另一方面，四个单点突变4-草酸丁烯酸酯异构体酶只能形成单体蛋白质离子。这些数据阐明自然蛋白具备寡聚行为，残基对保持六倍体构造有重要作用。在Standing等研究基本上，其她研究小组也开始用ESI-MS分析已知和未知寡聚蛋白质复合体化学计量式。在proteasome催化蛋白（89,90），chaperonecomplexGroEL[91]，和各种血色素[92-96]研究中均得到有趣成果。ESI-MS实验证明GroEL由两个七倍体环构成，并非共价结合14亚单元，总分子质量为800kDa[91]。GroEL在拥有co-chaperoneGroES前提下才具备活性。进一步用MS研究GroES可变某些与模型底物helixD互相作用[97]。结合荧光交联实验得到甚至在GroEL四倍体上也有GroES及底物蛋白明显，至少式某些结合位点。依照MS研究，在大多数哺乳动物系统中血色素以分子量约为60kDa四倍体存在，在低浓度下则很也许以二倍体存在。MS广泛用于研究血色素构造。例如，镰刀红血球患者组织血液中血色素S和胎儿血色素[98]。此研究总结了镰刀红血球病不均匀血色素混合物和其她四聚体定量测定。因此，血红素亚基非共价结合可用ESI-MS进行研究。质谱显示患者和胎儿血液均具有包括α2β2、α2γβ两种杂交体完整血红素四倍体。依照不均匀血色素杂和物质量测定，发当前患者血液中有一种平均质量为64.6kDa独特四倍体标记蛋白。另一种先进研究显示MS可用于甲状腺传递系统寡聚蛋白分析[99]。四倍体人类蛋白质reansthyretin通过与维生素A结合蛋白非共价结合传递荷尔蒙甲状腺素。Transthyretin被以为淀粉纤维构成成分，并与某些疾病如Alzheimer’s，二型糖尿病和遗传性海绵状组织脑病关于。在正常状况下，transthyretin运送甲状腺素和维生素A，但是天然型展开和单点突变分别导致老年系统淀粉样变性病和家族淀粉质神经病。Transthyretin四倍体分裂被以为是形成淀粉状纤维第一步[100]。McCammon等用MS实验了18种这一过程抑制剂(99)。测定了这些配体结合，稳定四倍体构造，与transthyretin复合体互相作用及与自然配体甲状腺素竞争能力。通过对具有六个蛋白质亚基，两个维生素A分子和两个合成配体（四个transthyretin和两个维生素A结合蛋白）多面十组分复合物研究发现配体加入不会抑制transthyretin与维生素A结合。甲状腺素与作为探针人工合成配体作用特点则不同样。研究积极、悲观与无作用机理；并证明人工配基对甲状腺素结合产生悲观影响。Loo等[]对ADH(AlcoholDehydrogenase)锌金属酶在乙醛、乙醇互变中作用进行了研究，表白酵母及哺乳动物ADHs都是均质，在这个过程中，仅有25％残基参加互变。在ESIMS分析蛋白质亚基构造过程中，溶液pH及离子源条件都很重要，在不同pH值下，蛋白质以不同数目亚基汇集体存在。这对咱们研究蛋白质性质具备重要意义。Standing等[]FitzgerraldMC，ChermushevishI，StandingKG，etal.Acad.Sci.USA[J]，1996,93:6851.采用ESI-TOF-MS对4OT酶低聚构造进行分析、测试，成果表白在溶液中其以六聚体存在，这和以往X-Ray衍射成果一致。对SilurusAsotusRoeLectin(SAL)ESIMS测定表白SAL单体分子量为31750Da，而沉淀平衡法测定分子量为95200Da。由此可以阐明该蛋白质在溶液中以三聚体形式存在。经基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定验证了这一推断[]MurayamaK，TakaH，KagaN，etal.Anal.Biochemistry[J]，1997,247:319.。Lafitte对钙调节蛋白在溶液中及变性条件下蛋白质聚合体研究与超离心测定成果一致[36]LafitteD，HeckAJR，HillTJ，etal.Eur.J.Biochem[J].，1999,261(1)：337.3.2蛋白质和配体MS用于配体-蛋白质非共价作用研究最初关注于完整亚铁血红素-肌血球素化合物[40]及完整复合FK结合蛋白（FLBP）[61]，后者为免疫抑制结合蛋白，可与免疫抑制剂FK506、rapamycin结合。非共价ESI-MS可以测定蛋白质-配体化合物分子质量，因此它可以精准区别结合在同一位点上两个接近有关配体。Ras蛋白结合GDP和GTP研究有力证明了这一点[73,74]。ras蛋白为细胞生长调节蛋白；结合GDP后活性丧失。因而，研究细胞生长过程对于区别GDP-ras蛋白与GTP-ras蛋白非常重要。依照分子质量差别，以上两种非共价结合物很容易通过ESI-MS区别出来（MwGDP-ras=19295Da；GTP-ras=19375Da）。ESI-MS不但可用于拟定配体质量及其结合化学计量，它还可用于预计溶液中不同蛋白质-配体相对强度[75-77]。杨松成等[]王红霞，张学敏，杨松成等.中华人民共和国科学（C辑），，32（4）：355－360.系统地用电喷雾质谱研究了重组人受体蛋白FKBP12(rhFKBP12)和其小分子神经生长增进剂配体非共价键互相作用，从52个化合物中筛选出3个有非共价键结合化合物000107，000308和A2B12，并通过竞争实验测定了它们与rhFKBP12结合位点和相对结合强度。其中000107和000308与rhFKBP12非共价键复合物X晶体衍射成果与ESI-MS成果吻合。小分子化合物000308在鸡胚背根神经节无血清培养实验中有较好促神经生长活性，表白ESI-MS可以在分子水平上为新药筛选提供根据，是很有发展前程新办法。Rostom等[80]发现58kDa外周胞质氨基酸受体蛋白OppA可与11个不同性质多肽发生作用。将具备2，3和5个氨基酸残基多肽加入到OppA中。ESI-MS实验证明，OppA与三肽、二肽均可形成化合物，其中前者亲和力较大，而与五肽或N-末端乙酰化后三肽无法形成化合物。具备单一D氨基酸残基三肽与天然OppA无法结合。对氨基酸结合比例和低能量MS条件下自由蛋白分析与液相Kd测定成果相似。此研究得到成果较好反映了这一蛋白无论序列可包括细胞二肽和三肽生理特性。3.3蛋白质和金属金属离子对酶催化性及构造稳定性都非常重要，同步对许多蛋白质生物功能也具备重大作用。研究金属离子与蛋白质互相作用办法有许多（如吸取光谱、园二色谱、NMR等）。近年来采用-./*.研究两者互相作用也获得了很大进展。结合金属离子后，依照ESI-MS测得蛋白质质谱变化可得到直接、精确金属与蛋白质结合化学计量数据[66-68]。等用ESI-MS预计Ca2＋结合蛋白（calbindinD28k）金属结合化学计量式[69]。老式办法以为calbindinD28k具备3－6个Ca2+结合位点[70-72]。ESI-MS最后显示一种calbindinD28k分子可结合4个Ca2＋离子[69]。无Ca2＋蛋白质和结合Ca2＋后质量相差151Da（4×38＝152）。Ca2＋离子质量为40Da，而质谱得到每增长一种Ca2＋质量增长38Da。这是由于Ca2＋及二价金属离子普通在结合时会代替两个质子（2Da）。Witkowska[]WitkowskaHE，ShackletonCHL，Dahlman-WrightK，etal.J.AM.Chem.Soc[J].，1995,117:3319研究了糖皮质激素受体DNA构造域与Zn2+、Ca2+结合特性。成果表白糖皮质激素受体具有2个锌指，每4个半胱氨酸残基与一种Zn2＋作用，在CysCysHisCys型锌指构造中二个巯基各脱去一种质子后与Zn2＋结合。近年来，对钙调节蛋白与金属离子Ca2＋，Cd2＋结合，以及钙调节蛋白-蜂毒素-Ca2＋研究证明ESIMS已逐渐成为探测蛋白质-金属离子复合物重要工具之一[]ChazinW，VeenstraTD.RapidCommunicationsInMassSpec[J].，1999,13(6):548.VeenstraTD，TomlinsonAJ，BensonL.J.Am.Soc.MassSpectrom[J].，1998,9(6):580.3.4蛋白质和核苷酸最初ESI-MS研究研究之一是将ds-DNA与真核tRNA因子（PU1）DNA-结合位点连接起来（81）。PU.1-DNA结合位（DBD）蛋白与天然型目的DNA序列混合物产生ESI-MS谱图仅浮现1:1蛋白质-ds-DNA化合离子和自由ds-DNA。当序列不同PU.1-DBD蛋白质，天然目的蛋白和突变目的蛋白混合时，仅得到与天然蛋白1:1化合物，这与凝胶电泳实验成果一致。这些数据充分阐明PU.1蛋白质DNA化合物不但仅是由碱性氨基酸与负离子磷酸DNA骨架作用导致。并且，数据突出蛋白质之间特定作用序列。Potier等用相似办法测定蛋白质-DNA化合物[82]。ESI-MS用于研究了trpapo-repressor(TrpR)，色氨酸及它们特定操纵子DNA序列互相作用。Trpoperator/repressor是生物化学领域研究最多翻译系统[83]。结合色氨酸后，repressorprotein变化构形，并使其得以结合于其操纵DNA序列，从而抑制其基因表达。在5mM醋酸铵中，TrpR为某些展开单体。结合TrpR必要在具有两个对称排列CTAG21个碱基对DNA，同步形成1:1同型二聚体。此外，为了鉴定TrpR与其目的蛋白结合特异性，它们做了竞争实验。此实验中，她们将蛋白质与相似浓度三种不同DNA混合，分离出CTAG序列分别为2，4，6bp。仅4bpDNA序列可与TrpR作用。这个实验表白，ESI-MS也可用于蛋白质-DNA化合物作用序列鉴定。虽然ESI在蛋白质-DNA化合物中应用相对较新，这两个报道阐明MS可以提供精准结合化学计量数。对于一种特定DNA序列来说，可以拟定某一蛋白与其发生亲和作用特点。但是，在分析蛋白质－DNA化合物时，DNA磷酸骨架极性过高。碱金属离子与寡核苷酸极易发生紧密结合，这样会使峰宽加大，并使质量测定发生偏差。然而，当前。MS辨别率对于钠加合物来说还是足够。展望在现今生命科学发展中,以迅速、敏捷检测办法来提供分子间互相作用信息及生物大分子构造信息将为咱们从分子水平上结识生命现象提供极大协助。以生物质谱如ESIMS、MALDIMS等参加分析、测试手段办法将在这片新科研领域中越来越显示其重要性。从前面讨论中咱们已懂得在非共价复合物研究中，需要对实验条件进行细致设计、安排。虽然已有多篇关于采用MS研究非共价键和复合物研究报道，但每一详细样品仍需采用不同条件及办法R同步由于经验局限性>在解析质谱谱图中仍有一定难度，这需要广大科研工作者进一步努力。MS并不能为咱们提供物质构造直观图像，因而需要咱们依照所测大分子各片段质量数进一步推测。完全依托MS分析样品分子构造及分子间互相作用还是有一定难度。但是它提供了NMR、X-Ray衍射等办法所不能测得信息。对咱们前沿研究仍具备重大意义。咱们有理由相信，在将来分析中将会建立起一系列基于MS参加分析、研究新仪器分析办法。Title:

Electrospray-ionizationmassspectrometryforproteinconformationalstudiesAuthor(s):

\o"one-clicksearch"GrandoriRSource:

CURRENTORGANICCHEMISTRY7(15)：1589-1603OCTDocumentType:

ReviewLanguage:

EnglishCitedReferences：146

TimesCited：1

Abstract:

Thepossibilitytostudylargemoleculesandtheirnon-covalentinteractionsbymassspectrometry(MS)hasopenednovelwaystoinvestigateproteinfoldingandbindingreactions.MScanbeappliedtoproteinconformationalstudiesintwoconceptuallydifferentways.OneapproachusesMStomonitormasschangesproducedbyconformation-sensitivereactions，suchashydrogen/deuterium(H/D)exchange，alkylationandradiolysis.Thesecondapproachdirectlyexploitstheconformationdependenceofthecharge-statedistributions(CSDs)ofthemultiplychargedproteinionsproducedbyelectrospray-ionization(ESI).Thisreviewfocusesontheinformationthathasbeenprovidedbythelatterkindofstudies.Anattemptismadetosummarizeanddiscusstheavailableevidenceaboutthemechanismunderlyingthistechniqueanditspossibleapplications.Theresultsofthestudiesdescribedhereincludeequilibriumandkineticcharacterizationofproteinfoldingtransitionsanddetectionoffoldingintermediates.Thecasestudiesofmyoglobin(Mb)andcytochromec(cytc)arediscussedinparticulardetail.TheunprecedentedadvantagesofferedbyMSintheanalysisofheterogeneoussamplescannowbeappliedtothestudyofdynamicsystemsinvolvingdifferentconformationalstates.KeyWordsPlus:

CHARGE-STATEDISTRIBUTIONS；PROTON-TRANSFERREACTIVITY；MOLTEN-GLOBULESTATE；CYTOCHROME-CIONS；GAS-PHASE；STRUCTURALCHARACTERIZATION；DYNAMICCHARACTERIZATION；FOLDINGINTERMEDIATE；THERMAL-DENATURATION；HYDROGEN-EXCHANGEAddresses:

GrandoriR(reprintauthor)，JohannesKeplerUniv，InstChem，Altenbergerstr69，Linz，A-4040Austria

JohannesKeplerUniv，InstChem，Linz，A-4040AustriaPublisher:

BENTHAMSCIENCEPUBLLTD，POBOX1673，1200BRHILVERSUM，NETHERLANDSSubjectCategory:

CHEMISTRY，ORGANICIDSNumber:

730EXISSN:

1385-2728Title：Electrosprayionizationmassspectrometryinthestudyofbiomolecularnon-covalentinteractionsAuthor(s)：\o"one-clicksearch"Veenstra，TimothyD.Source：BiophysicalChemistry79(2)：63-79June7，1999Language：EnglishMedium：printAbstract：Inthepastmassspectrometryhasbeenlimitedtothestudyofsmall，stablemolecules，however，withtheemergenceofelectrosprayionizationmassspectrometry(ESI-MS)largebiomoleculesaswellasnon-covalentbiomolecularcomplexescanbestudied.ESI-MShasbeenusedtostudynon-covalentinteractionsinvolvingproteinswithmetals，ligands，peptides，olig