细胞程序性死亡和细胞衰老培训课件

细胞程序性死亡和细胞衰老一、程序性细胞死亡PRIZEDHorvitz,andSulstonsharePhysiologyorMedicineNobel（2002）

“fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath”2细胞程序性死亡和细胞衰老1090–131=959(cells)秀丽广杆线虫(Caenorhabditiselegans

)

3细胞程序性死亡和细胞衰老

4细胞程序性死亡和细胞衰老概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，也常常被称为细胞程序死亡（programmedcelldeath，PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。5细胞程序性死亡和细胞衰老

蝌蚪尾的消失

6细胞程序性死亡和细胞衰老脊椎动物的神经系统的发育

7细胞程序性死亡和细胞衰老发育过程中手和足的成形过程8细胞程序性死亡和细胞衰老9细胞程序性死亡和细胞衰老细胞凋亡的生理和病理学意义生理学意义1.生长发育：组织与器官的塑造（趾的分化）；动物变态；皮肤角质形成；2.免疫细胞分化：克隆选择；3.防御：清除衰老细胞、DNA损伤的细胞、和被病原体感染的细胞。10细胞程序性死亡和细胞衰老病理学意义1.病原体侵染；诱导凋亡——HIV抑制凋亡——Poxvirus2.细胞凋亡不足肿瘤，自身免疫疾病；3.细胞凋亡过度神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、再生障碍性贫血、骨组织坏死。11细胞程序性死亡和细胞衰老胸腺细胞正常凋亡细胞凋亡的形态学和生物化学特征12细胞程序性死亡和细胞衰老胸腺细胞正常凋亡13细胞程序性死亡和细胞衰老细胞凋亡的形态学和生物化学特征坏死细胞凋亡细胞14细胞程序性死亡和细胞衰老细胞凋亡的形态学特征15细胞程序性死亡和细胞衰老细胞凋亡的生化特征16细胞程序性死亡和细胞衰老诱导细胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射线（紫外线，

射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子

（TNF

），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等17细胞程序性死亡和细胞衰老细胞凋亡的检测方法1.形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察2.DNA电泳——ladder3.流式细胞技术4.彗星电泳法（cometassay）5.AnnexinV检测细胞膜外表面PS(磷脂酰丝氨酸)6.TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法18细胞程序性死亡和细胞衰老19细胞程序性死亡和细胞衰老彗星电泳法20细胞程序性死亡和细胞衰老AnnexinV检测细胞膜外表面PS21细胞程序性死亡和细胞衰老/22细胞程序性死亡和细胞衰老区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小体破损染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬基因组DNA有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行炎症反应无，不释放细胞内容物有，释放内容物。23细胞程序性死亡和细胞衰老常用检测细胞凋亡的染料：二乙酸荧光素（FDA），绿色荧光，活细胞染色。Hoechst33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强。溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放线菌素D（7-AAD），不通透，正常和凋亡细胞拒染。可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色。24细胞程序性死亡和细胞衰老细胞凋亡的分子调控机理线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。 25细胞程序性死亡和细胞衰老Caspase家族与凋亡◆Caspase家族Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase.Caspase1即ICE(白介素-1b转换酶),是Ced3在哺乳动物细胞中的同源蛋白.26细胞程序性死亡和细胞衰老Caspaseclassification（Zimmermann2001）ExecutioneroreffectorAutocatalyticinitiator27细胞程序性死亡和细胞衰老Caspase家族与凋亡

Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化Caspase活化28细胞程序性死亡和细胞衰老胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptorprotein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡.下游Caspases活化后，作用于底物，裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。29细胞程序性死亡和细胞衰老Caspase活化的两条途径30细胞程序性死亡和细胞衰老Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡◆Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH331细胞程序性死亡和细胞衰老Bcl-2genefamily（Zimmermann2001）32细胞程序性死亡和细胞衰老Bcl-2、线粒体与细胞凋亡当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起细胞凋亡.33细胞程序性死亡和细胞衰老Apaf-1凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），线虫的同源物为ced-4。作用：参与线粒体凋亡途径，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。Apaf-1与cytc、ATP/dATP结合后，召集caspase-9，形成凋亡体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。34细胞程序性死亡和细胞衰老FasFas又称作APO-1/CD95，属TNF受体家族。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T和B淋巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑、肠、睾丸和卵巢细胞等。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡。35细胞程序性死亡和细胞衰老p53

是一种抑癌基因，其生物学功能是监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡36细胞程序性死亡和细胞衰老myc

在许多人类恶性肿瘤细胞中都发现有c-myc的过度表达，它能促进细胞增殖、抑制分化。在凋亡细胞中c-myc也是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。37细胞程序性死亡和细胞衰老细胞凋亡的途径

细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的caspase、另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。38细胞程序性死亡和细胞衰老1．Fas介导的细胞凋亡――凋亡受体途径细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的跨膜蛋白，它们包括Fas（Apo-1/CD95）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL-R1和DR5/TRAIL-R2。其配体属于TNF家族，目前已比较清楚的是Fas介导的细胞凋亡途径。39细胞程序性死亡和细胞衰老2．线粒体与细胞凋亡细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素c释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素c能与Apaf-1、caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡复合体（apoptosome），然后召集并激活caspase-3，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。40细胞程序性死亡和细胞衰老41细胞程序性死亡和细胞衰老MitochondriafunctionduringcellapoptosisR.ChrisBleackleyandJeffreyA.Heibein200142细胞程序性死亡和细胞衰老细胞坏死43细胞程序性死亡和细胞衰老细胞自噬-细胞中寿命较长蛋白的降解方式由溶酶体进行降解

细胞中出现双层膜包被的自噬泡-自噬小体细胞可通过自噬自我销毁

分子机制了解较少,明确的有PI3K44细胞程序性死亡和细胞衰老45细胞程序性死亡和细胞衰老细胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)●Hayflick界限(HayflickLimitation）●细胞在体内条件下的衰老●衰老细胞结构的变化●细胞衰老的分子机理46细胞程序性死亡和细胞衰老细胞来源人胚肺成纤维细胞中年人成纤维细胞老年人成纤维细胞可增殖代数40-60202-4不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数48细胞程序性死亡和细胞衰老细胞在体内条件下的衰老●在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生●正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随着有机体年龄的增高而下降？它们会不会衰老？◆衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长◆衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老◆骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢49细胞程序性死亡和细胞衰老衰老细胞结构的变化●细胞核的变化●内质网的变化:衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了●线粒体的变化 ◆通常，细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大●致密体的生成50细胞程序性死亡和细胞衰老衰老细胞结构的变化●膜系统的变化

◆衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小◆衰老细胞间间隙连接及膜内颗粒的分布也发生变化51细胞程序性死亡和细胞衰老核增大、染色深、核内有包含物染色质凝聚、固缩、碎裂、溶解质膜粘度增加、流动性降低细胞质色素积聚、空泡形成线粒体数目减少、体积增大、mtDNA突变或丢失高尔基体碎裂尼氏体消失包含物糖原减少、脂肪积聚核膜内陷衰老细胞的形态变化52细胞程序性死亡和细胞衰老分子水平的变化1.

DNA：复制与转录受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。2.

RNA：含量减少。3.

蛋白质：合成下降，发生修饰、交联。4.

酶分子：物理与化学特征改变，酶失活。5.

脂类：不饱和脂肪酸被氧化。53细胞程序性死亡和细胞衰老细胞衰老的分子机理1.代谢废物积累：如：脂褐质，老年性痴呆（AD）脑细胞内的β-淀粉样蛋白。2.线粒体DNA突变：线粒体自由基浓度高，mtDNA是裸露分子，容易发生突变。脑、心、骨骼肌的氧负荷最大，组织最易衰老。caloricrestriction能延长大鼠寿命50%-70%。54细胞程序性死亡和细胞衰老ThinratburyfatratTheratsareboth1000daysold,veryoldforrats.Theoneontherightwascalorierestricted.Theoneontheleftisneardeathandshowstypicalsignsofoldagesimilartowhathappensinhumans.ImagecitedfromCliveMcCay1939.55细胞程序性死亡和细胞衰老●氧化性损伤学说:该理论认为，代谢过程中产生的活性氧基团或分子（reactiveoxygenspecies，ROS）引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。ROS主要有三种类型：

◆O2-，即超氧自由基；

◆OH-，即羟自由基；

◆H2O2。它们的高度活性引发脂类、蛋白质和核酸分子的氧化性损伤，从而