DB36-T 1904-2023 实验动物 支原体荧光定量PCR检测方法

ICS

65.020.30CCS

B

44

DB36江 西 省 地 方 标 准DB36/T

实验动物

支原体荧光定量

检测方法Laboratory

animal—real-time

quantitative

method

for

of

–

江西省市场监督管理局 发

布DB36/T

1904—2023 前 言

.............................................................................

II1

范围

..............................................................................

12

规范性引用文件

....................................................................

13

术语和定义

........................................................................

14

缩略语

............................................................................

25

设备和材料

........................................................................

26

试剂

..............................................................................

27

检测流程

..........................................................................

28

结果判定

..........................................................................

4附录

溶液配制方法....................................................

5附录

荧光定量

的引物与探针........................................

7附录

荧光定量

检测方法............................................

8参

考

文

献

..........................................................................

9IDB36/T

1904—2023 本文件按照

GB/T

1.1-2020《标准化工作导则

第

1

草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：江西省职业病防治研究院。本文件主要起草人：肖芳平、张陆兵、周银平、熊莉娟、万筱荣、贾菠、刘欢、罗勇兵、谢金明、周剑、李银才。IIDB36/T

1904—2023实验动物

支原体荧光定量

PCR

检测方法1 范围本文件规定了实验动物支原体荧光定量PCR流程和结果判定等内容。本文件适用于小鼠、大鼠中支原体的检测，饲养环境中支原体的检测参照执行。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，本文件。GB/T

分析实验室用水规格和试验方法GB

实验动物

微生物、寄生虫学等级及监测GB

实验室

生物安全通用要求GB/T

转基因产品检测

实验室技术要求GB/T

实验动物

3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1支原体

mycoplasma

~0.6μm胞壁，仅有三层结构且富含胆固醇的细胞膜。大多数的支原体都具有种属特异性。3.2荧光定量聚合酶链式反应

real-time

quantitative

polymerase

chain

reaction;

real-time

在常规PCR个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'PCR反应的循环进行，PCR系，通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。3.3Ct

值

cycle

1DB36/T

1904—2023荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸

acid)；PBS：磷酸盐缓冲液

buffered

；Taq

酶：Taq

DNA

聚合酶

(Taq

DNA

；5 设备和材料5.1 设备设备包括但不限于：高压灭菌锅、荧光定量PCR4

℃、

℃、

℃

μL、2

、20

μL~200

、100

μL~1000

）。5.2 材料灭菌离心管（

、1.5

mL、5

mL、15

mL）、灭菌吸头、灭菌PCR扩增反应管、剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。6试剂

6.1

本文件所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水符合

6682

的要求。6.2

灭菌

PBS

A

中

A.1）。6.3

裂解液（配制方法见附录

A

中

A.5）。6.4

蛋白酶

K（配制方法见附录

A

中

A.6）。6.5

乙酸钾溶液（配制方法见附录

A

中

）。6.6

Tris-饱和酚：＞7.8。6.7

氯仿/异戊醇∶1)

：将氯仿和异戊醇按照体积比

24∶1

的比例配制。6.8

无水乙醇：

℃预冷。6.9

70%

A

中

A.8）。6.10

TE

缓冲液（配制方法见附录

A

中

A.9）。6.11

DNA

抽提试剂盒:商品化试剂盒。6.12

荧光定量

PCR

试剂盒：商品化试剂盒。6.13

引物与探针（见附录

B

中

B.1）。6.14

阳性对照：支原体

DNA。6.15

阴性对照：不含支原体

DNA。7 检测流程7.1 生物安全要求2DB36/T

1904—2023实验操作及处理按照GB

19489GB/T

19495.2中的要求执行。采样参照GB

14922中的要求执行。7.2 样本采集7.2.1 脏器组织按照GB/T

取待检样本2.0

g于无菌15

离心管中，密封、编号，待检。7.2.2 实验动物垫料取1.0

g实验动物垫料置于

离心管中，密封、编号，待检。7.2.3 实验动物设施设备用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌15

离心管中，密封、编号，待检。7.3 样本处理7.3.1脏器组织在生物安全柜内用灭菌剪刀将脏器组织剪碎后，加入4

灭菌PBS，使用电动匀浆器充分匀浆2，编号备用。7.3.2 实验动物垫料和实验动物设施设备向装有样品的离心管中加入4

灭菌PBS（垫料或棉拭子需全部浸泡于液体中）。密封后浸泡，充分混匀，静置30

，取上清液转入另一无菌5

离心管中，编号备用。7.4样本存放采集或处理的样本在2

℃～8

24

h

℃冰箱保存，避免反复冻融。7.5 样本

提取7.5.1 样本

DNA

提取步骤如下：a) 取

350μL

已处理好的样品加入

的蛋白酶

K

℃水浴

2

h

或

37

℃消化过夜；b) 向消化后的裂解液中加入

70μL

10

，4

℃，12000

g

离心

上清液转移至新的

离心管；c) 加入等体积的

Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀

10

，4

℃，12000

g

离心

10

；d)

倍体积的

Tris-饱和酚和

0.5

倍体积的氯仿/24∶1），12000

g

离心

10

；e) 取上清液至新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），12000

g

离心

10

；f) 取上清液至新的离心管中，加入

2

倍体积

℃预冷的无水乙醇，轻轻摇晃至絮状沉淀析出，12000

g

离心

10

，弃上清；g) 加入

70%乙醇冲洗沉淀表面及管壁，12000

g

离心

3

，吸去上清液；3DB36/T

1904—2023h) 室温下放置

2

100

TE

缓冲液溶解

DNA

沉淀，即可用于检测或

℃保存备用。7.5.2 样本

DNA

也可采用同等效果的商品化试剂盒提取，提取按照试剂盒的使用说明书操作。7.6 荧光定量

荧光定量PCR检测应符合附录C。8 结果判定8.1 质控标准阳性对照

Ct

值≤35，且出现对数扩增曲线。阴性对照及空白对照无

Ct

值，且无对数扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。8.2 检测结果判定符合

Ct

值≤

Ct

值且无对数扩增曲线，判定为阴性。被检样本

＜Ct

值≤40

时，重复一次，如果

Ct

值仍然≤40，并且曲线有明显的对数增长期，则判定阳性；否则判定阴性。4DB36/T

1904—2023AA附 录 A（规范性附录）溶液配制方法A.1 灭菌

溶液NaCl）8.00

g）0.20

gPO）0.24

g钠（NaHPO·12H0）3.65

g，先加入800

去离子水溶解，调节溶液至7.2~

，定容至1000

。在103.4

kPa（℃）条件下灭菌20

，冷却备用。A.2 0.5mol/L

乙二铵四乙酸二钠溶液（pH

8.0）称取18.6

g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na），加入80

水中，充分搅拌，用氢氧化钠（）颗粒调至，加水定容至100

。在103.4

（℃)条件下灭菌20

。A.3 1

mol/L

三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH

8.0）称取121.1

gTris)溶解于

HCl至8.01000

。在103.4

kPa（℃）条件下灭菌20

。A.4 5

mol/L

称取29.22

g氯化钠（NaCl）溶于80

mL水中，加水定容至

mL。在103.4

（121℃）条件下灭菌20

。A.5裂解液在约

水中，依次加入10

0.5

乙二铵四乙酸二钠溶液、20

1

三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、80

5

氯化钠溶液。另称取10

gCHOSNa，SDS），混合后加热至完全溶解后冷却至室温，用水定容至1000

，室温保存备用。A.6 蛋白酶

K

溶液将20

蛋白酶K（＞9.5

10

℃保存备用。A.7 乙酸钾溶液（pH

4.8）称取29.43

g）溶于HAc）调至4.8100

。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20

。5DB36/T

1904—2023A.870%乙醇取70mL无水乙醇，加入蒸馏水，充分混匀后备用。A.9 TE

缓冲液（pH

8.0）在约

10

1

三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液和2

0.5

乙二铵四乙HCl至8.01000mL103.4kPa（121

。6DB36/T

1904—2023BB附 录B（规范性附录）荧光定量

B.1 引物与探针序列正向引物 5’-ATGGAGTGACACAGCGTGCA-3’反向引物探针 注：探针可选用具有与和BHQ-1荧光基团相同效果的其他荧光报告基团和荧光淬灭基团。7反应组分用量终浓度2×

10μL1×正向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L反向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L探针（10μmol/L）0.4μL200nmol/LDNA模板2μL-灭菌去离子水-总体积20μL-注：反应体系可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。步骤温度时间采集荧光信号循环数预变性95℃-1变性95℃10s-40退火60℃30s-延伸72℃30s是注：反应参数可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。DB36/T

1904—2023CC附 录 C（规范性附录）荧光定量

C.1 荧光定量PCR反应体系反应液的配制应在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照。以支原体DNA作阳性对照、不含支原体的DNA作阴性对照、以灭菌去离子水作空白对照。表C.1 每个荧光定量

反应体系C.2 荧光定量PCR反应条件表C.2 荧光定量

反应条件8DB36/T

1904—2023参

考 文 献[1]

辛闻婷,杨媛媛,王馨宇,等.实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立[J].实验动物科学2019,36(05):60-65．[2]

章凌,吕国贞,邹勇,等.上海市卫生系统实验大小鼠常见病原菌调查[J].中国实验动物学杂志,1991(02):66．[3]

Cahill

J

Cole

B

C

,WileyB

B,

et

Role

of

Biological

Mimicry

Pathogenesis

of

Rat

Induced

byMycoplasma

arthritidis[J].

&

1971,

3(1):24-35．[4]