细胞培养室设置培训课件

细胞培养室设置实验室组成基本设施配置常用器皿、器械培养基的成份、配制与选择实验室操作注意事项卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置2一.实验室组成卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置3一.实验室组成

细胞培养实验室的设计是由工作的目的和规模决定的，其基本要求是：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。

细胞培养实验室的设置必须满足三个基本的需要，即：实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌等）、无菌操作、控制培养。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置4一.实验室组成基本实验室

消毒准备室制备室无菌操作室辅助实验室

细胞学实验室生化分析室摄影室及暗室卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置基本组成：5一.实验室组成消毒准备室制备室无菌操作室卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置1.基本实验室：6一.实验室组成消毒准备室

功能

一切与实验有关的准备工作要求

设备的安装和排列要合理

房间要宽敞明亮，通风条件好

地面要便于清洁、防滑配备

实验台，高压灭菌锅、排风灭火设备

干热消毒柜、超声波清洗器、洗瓶机等。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置7一.实验室组成制备室

功能

进行培养液及相关试剂的配制要求

在无菌操作台内过滤、除菌。配备

冰箱、天平、真空泵、PH计等。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置8一.实验室组成无菌操作室地面、天花板及四壁尽可能光洁，无死角，易于清洁。大小适度，层高不高于2.5米。干爽、安静、清洁、明亮。紫外灯1－2盏，保持室内无菌状态。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置9一.实验室组成无菌操作室设置空气过滤和恒温恒湿装置，恒温温度26度左右。保持正压，尽量减少与外界的空气对流，减少尘埃与微生物侵入。通常由内外间组成，外间为缓冲间，用于准备工作。研究人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置10一.实验室组成细胞学实验室

对培养材料进行细胞学鉴定和研究，要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室

其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。生化分析室

在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置2.辅助实验室：11单元小结：

基本的细胞培养室应包括消毒准备室、制备室、无菌操作室。

无菌室的设置标准。

卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置12二.基本设备配置卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置13二.基本设备配置卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置基本设备灭菌设备无菌操作设备光温控制设备细胞培养设备细胞学鉴定设备14二.基本设备配置冰箱天平酸度计恒温水浴锅磁力搅拌器液氮罐纯水设备卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置1.基本设备15卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置16卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置17PH7.0～7.4

去离子水

无菌

卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置18卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置19二.基本设备配置蒸汽压力灭菌锅干热消毒柜过滤灭菌装置喷雾消毒器紫外灯卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置2.灭菌设备20卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置21卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置消毒物理消毒射线、紫外线、干热、湿热、滤过化学消毒来苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸、70%酒精220.45μm

0.22μm卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置23二.基本设备配置净化工作台生物安全柜卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置3.无菌操作设备24超净台原理：内设鼓风机，驱动空气通过高效滤器过滤，净化后的空气以水平或垂直气流的状态送出，从而形成无菌洁净工作环境。分类：垂直流超净工作台，水平流超净工作台；单边操作台，双边操作台；普通操作台，医用（生物）操作台。维护：检查滤膜，定期清洗，更换。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置25生物安全柜根据主要几项生物安全柜国际标准的规定，安全柜可分为一级、二级和三级三大类以满足不同生物研究和防疫的要求。安全柜的分类级别与生物安全登记无关。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置26一级生物安全柜

保护工作人员和环境，而不保护样品。排气口安装有HEPA过滤器。无自带风机，依赖外接通风管中的风机带

动气流。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置27二级生物安全柜可提供对样品，环境，工作人员的保护。排气口安装有HEPA过滤器，独有特征是具有垂直层状薄片（无定向的）HEPA过滤器。内置风机，形成下沉气流无自带风机，依赖外接通风管中的风机带

动气流。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置28三级生物安全柜为3－4级实验室生物安全等级而设计，柜体完全气闭。通过手套进行操作，俗称“手套箱”。实验品通过双门的传递箱进出。适用于高风险的生物实验。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置29确认通风橱已经打开，并且空气正在循环。把框格降低到刻度处不要阻碍空气流通使用前用70％乙醇擦拭台面不要使用酒精灯减少手臂再通风橱内晃动卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置30二.基本设备配置时间程序控制器空调及温度感应器卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置4.光温控制设备31二.基本设备配置CO2培养箱离心机卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置5.细胞培养设备32温度：37℃±0.5℃

CO2浓度：5%

相对湿度：100%

定期清洗、消毒

卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置33卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置罐内压力指示接培养箱的管子输出压力指示压力调节旋钮流量控制阀门34卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置固定角式转子水平转子垂直转子1000RPM10MIN配平35二.基本设备配置倒置显微镜荧光显微镜酶标检测仪流式细胞仪卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置6.细胞学鉴定设备36卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置37卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置单元小结：

细胞培养实验室基本设备：离心机、倒置显微镜、冰箱、无菌操作台、液氮罐。

II型生物安全柜的使用规范。

CO2培养箱、离心机的使用规范。

38三.常用器皿、器械卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置39三.常用器皿、器械解剖器具培养器皿移液器特殊用具卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置40三.常用器皿、器械解剖器具

主要用于解剖动物、取材和原代培养中切割组织。常用的手术器械有手术刀柄及刀片（圆形或尖型）、组织剪、眼科剪（直头和弯头）、镊子（平齿、鼠齿）、尖镊、止血钳、持针器等。

各种器械至少要准备两套，以备轮换消毒用。各种金属器械使用后，要及时刷洗干净，用干净纱布拭干，上一薄层液体石蜡，以防生锈。消毒法采用高压蒸汽灭菌或采用70％乙醇浸泡消毒。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置41三.常用器皿、器械培养器皿

如溶液瓶、培养瓶、培养皿、培养板等。多孔培养板材料仅有塑料的一种，适宜少量细胞和单克隆生长，也适宜进行分组比较的生化、药理、毒理等方面的实验，其规格主要有6孔，12孔、24孔、96孔培养板。

移液管和吸管移液管有刻度，可定量移液，有玻璃和塑料2种，常用规格为10ML、5ML、1ML。

其它器皿烧杯、量筒、漏斗，细胞冻存管等。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置42细胞培养室设置43三.常用器皿、器械移液器电动移液器微量移液器多通道微量移液器卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置44三.常用器皿、器械特殊用具

细胞筛网、细胞刮刀、细胞计数板卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置45三.常用器皿、器械单元小结：

了解常用器械种类，用途。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置46四.培养基的成份、配置与选择卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置47四.培养基的成份、配置与选择卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置细胞培养基的基本要求细胞培养基分类常用细胞培养基干粉培养基的配制细胞培养基的选择48四.培养基的成份、配置与选择细胞培养基的基本要求营养成分:12种必须氨基酸、葡萄糖、维生素、无机离子与微量元素促生长因子及激素：胰岛素、氢化可的松、泌乳素渗透压：260－320mOsm/kgpH、气体：

pH值约7．2～7．4。CO2浓度（5％）

无毒、无污染卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置49四.培养基的成份、配置与选择细胞培养基分类

按其物质状态：

半固体培养基和液体培养基两类

按其来源：

合成培养基和天然培养基卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置50四.培养基的成份、配置与选择天然培养基

最普遍使用的天然培养基是血清，基本以小牛血清最为普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。常见使用最为5-20%。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置51四.培养基的成份、配置与选择血清培养基主要问题血清的准确成份、含量仍不清楚。批量生产的血清各批量之间差异很大，且保存期至多一年，因此实验的标准化和连续性受到限制。对大多数细胞，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。

卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置52四.培养基的成份、配置与选择血清培养基主要问题血清含一些对细胞产生毒性的物质。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。价格昂贵卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置53四.培养基的成份、配置与选择合成培养基：

根据细胞所需物质的种类和数量,用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断发展。酚红谷氨酰胺卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置55四.培养基的成份、配置与选择无血清培养基(serumfreemedium,SFM)

不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。优点：可避免血清批次间的质量变动，提高实验结果的重复性。避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。避免血清组分对实验研究的影响。有利于体外培养细胞的分化。可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置56四.培养基的成份、配置与选择无血清培养基(serumfreemedium,SFM)缺点：易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。成本较高针对性很强，仅适合某一类细胞的培养。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置57四.培养基的成份、配置与选择无蛋白培养基（proteinfreemidium,PFM）

不含有动物蛋白的培养基。从生物技术发展的趋势来看，不含动物蛋白的培养基有广泛的应用前景，许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如果在生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂，最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置58四.培养基的成份、配置与选择限定化学成分培养基(chemicaldefinedmedium,CDM)

指培养基中的素有成分都是明确的，它同样不含有动物蛋白，同样也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM问世。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置59四.培养基的成份、配置与选择MEM细胞培养基系列DMEM细胞培养基系列RPMI-1640细胞培养基系列199细胞培养基系列水解乳蛋白细胞培养基欧氏平衡盐F-10,F-12细胞培养基系列其它类型细胞培养基卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置常用细胞培养基60四.培养基的成份、配置与选择认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。

配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。

配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。

所用器皿应严格消毒。

配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置干粉培养基的配制61四.培养基的成份、配置与选择细胞培养基的选择卫生部抗体技术重点实验室细胞培养室设置细胞系细胞类型种组织培养基293成纤维细胞人胚胎肾MEM,10%热灭活马血清IMR-90成纤维细胞人肺MEM,10%胎牛血清和NEAAW1-38成纤维细胞人胚胎肺,3月妊娠MEM,10%胎牛血清A549上皮细胞人肺癌F-12K,10%胎牛血清A431上皮型人表皮细胞癌DMEM,10%胎牛血清BHL-100上皮细胞人乳房McCoy'5A,10%胎牛血清BeWo上皮滋养层人绒毛癌F-12K,15%胎牛血清Caco-2上皮细胞人结肠腺癌MEM,10%