细胞凋亡诱导及检测伍国羽

Hela细胞凋亡诱导及检测生72伍国羽2007012357实验日期：2009年11月15日星期日实验目的了解和掌握诱导细胞凋亡的基本原理和实验方法。巩固和提高细胞传代、细胞培养、显微镜操作等关键实验技术。学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法实验原理细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)﹐为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100%)，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。实验用品实验材料：HeLa细胞实验用具：荧光显微镜，显微摄影系统，超净操作台，恒温培养箱，离心机，恒温水浴锅，EP管，废液缸，细胞培养平皿，移液器，酒精灯，火柴，镊子，记号笔，酒精棉球，已灭菌枪头，载玻片，盖玻片。实验试剂：PBS缓冲液；DMEM培养基（DMEM+10%血清+1%双抗，pH约7.2）；消化液（0.25%胰蛋白酶-EDTA混合液）；H2O2溶液（8.8mmol/L）；固定液（甲醇溶液）；DAPI染液。实验步骤一、细胞凋亡的诱导(1)将对数增长期的细胞用0.25%胰酶消化，调整细胞数为4×105/L，胞悬浮于100μLDMEM培养基(2)加H2O2处理，至终浓度为0.8mmol/L(3)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。二、DAPI染色1.收集细胞(200uL胰酶37℃消化后，再加入1mL培养基)至1.5mLEP管，1000g离心5min2.吸出上清，于沉淀中加入100uL甲醇，室温固定10min3.1000g离心5min4.弃上清，加100uLPBS洗涤沉淀细胞5.1000g离心5min，6.弃上清，加50uLDAPI染液，于37℃染色10min7.1000g，离心5min8.弃上清，加100uLPBS洗涤；9.1000g，离心5min10.弃上清，加15uLPBS重悬细胞11.取15uL悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察实验结果与讨论31在进行凋亡诱导和染色后，利用荧光显微摄影系统进行拍照，得到如下所示的细胞图像：31100um2图1.Hela细胞凋亡诱导结果图。如图中箭头所示，1：Stage=1\*ROMANI的HeLa细胞；2：Stage=2\*ROMANIIa的Hela细胞；3：Stage=2\*ROMANIIb的Hela细胞。图中比例如图右下角红色数据表示。100um2细胞生存需要多种信号协同刺激,其中包括可溶性信号分子如激素、细胞因子以及细胞间膜蛋白及其配体的相互连接等。当细胞得到最适当的信号刺激,能存活并发挥生物学功能。若细胞仅受到部分、不完整的信号刺激,则促发凋亡。DAPI可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，在紫外光激发下会发出蓝色荧光，以此观察细胞核的变化情况。细胞凋亡时分为3个时期，分别是stageI、stageIIa和stageIIb。形态学特征是细胞先空泡化，再固缩，然后出芽，边集，最后形成凋亡小体。从图中可以观察细胞的凋亡状态，根据图中箭头指示，1：Stage=1\*ROMANI的HeLa细胞；2：Stage=2\*ROMANIIa的Hela细胞；3：Stage=2\*ROMANIIb的Hela细胞。（1）Stage=1\*ROMANI：箭头所指示细胞的细胞核内可以看到纹理，说明部分染色质发生浓缩和聚集。同时，可观察到核内边缘存在空泡状的结构。（2）Stage=2\*ROMANIIa：箭头所指示的细胞其细胞核的染色质高度浓缩，并且其染色质已经边缘化。（3）Stage=2\*ROMANIIb：箭头所指示细胞中，核内染色体已经分裂为大小不等的碎块，这表明细胞核已经裂解，凋亡小体已经产生。