生物化学实验论文 从啤酒酵母中提取蔗糖酶

./题名：酵母蔗糖酶的提取纯化与活力测定__宋烙学院：长三角绿色制药协同创新中心__绿色国际班__2012013914162013年12酵母蔗糖酶的提取纯化与活力测定XX工业大学绿色制药协同创新中心宋烙摘要：采用自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶,通过离心、热提取、95%乙醇沉淀提取、QSepharose-柱层析法来对蔗糖酶进行纯化。至于活力的测定,首先利用3,5-二硝基水杨酸〔DNS〕法测定5min内酶能催化生成葡萄糖的量来对得到的各个提取液进行蔗糖酶活力的测定。然后再通过Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量,之后就可以计算出各个提取液的比活力。最后,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蔗糖酶的相对分子质量。关键词：蔗糖酶；提取纯化；酶活力；蛋白质含量；相对分子质量TheExtractionMethodofBeerYeastSucroseandVitalityTestZhejiangUniversitySongLuoAbstract:Theautolysisextractssucrosefrombeeryeast.Then,purifyingthesucrosebycentrifugalization,hotextraction,95%ethanolsedimentextraction,andQ-Sepharose-columnchromatography.Asforcalculatetheradiooflive,firstofall,using3,5-dinitrosalicylicacid<DNS>tocalculatetheeachextractingsolution’sradiooflivebymeasurehowmuchsucrosethesucrosecancatalysis.Afterthat,calculatingthecontentofsucrosebyusingLowrymethod.,soit’savailabletocalculateeachextractingsolution’sspecificactivity.Finally,weusedSDS-polyacrylamidegeleletrophoresistomeasurethesucrose’srelativemolecularmass.Keyword:sucrose；extraction；vitality；specificactivity；relativemolecularmass前言：本实验的是一个综合性的教学实验,主要是为了让学生养成规X的科学实验习惯,树立严谨的科研作风。本次综合性的实验既保留了一些旨在加强学生基本实验方法和技能训练的传统实验,也引进了一些新近发展起来的生化实验技术。旨在培养我们的动手能力和良好的科研素质,使我们有一个完整的实验锻炼过程,培养了我们科研思维和独立展开科研工作的能力。蔗糖酶〔Sucrase,EC.26〕又称转化酶〔Invertase〕,1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在,蔗糖酶广泛存在于微生物、植物、动物中[1]。蔗糖在蔗糖酶的催化下生成葡萄糖和果糖。然而,蔗糖酶有多种同工酶,分别处于不同的亚细胞位置,生化特性也不尽相同。[2][3]蔗糖酶在啤酒酵母细胞汇总存在着两种形式。一种存在细胞膜外细胞壁中高度糖基化的胞外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分,含有50%糖的成分。该酶是啤酒酵母蔗糖酶的主要形式。而另外一种是存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的胞内蔗糖酶。材料与方法1.1材料与仪器材料啤酒酵母〔市售〕仪器高速冷冻离心机[Thermo<SORVALL>BIOFOGESTRATOS]；紫外分光光度计T6新世纪；恒温水浴槽；DYY-6D型电泳仪；凯氏定氮仪等。试剂醋酸钠〔AR〕；甲苯〔AR〕；4mol/L醋酸；95%乙醇；0.5mol/LTris-HClPH7.3缓冲液；0.05mol/LTris-HClPH7.3缓冲液；浓硫酸；硫酸钾与硫酸铜混合粉末；30%NaOH溶液；2mol/lNaOH溶液；0.5mol/lNaOH溶液；2%硼酸溶液；混合指示剂；0.01mol/LHCl标准溶液；试剂A〔碱性铜试剂〕；试剂B〔酚试剂〕；标准浓度牛血清蛋白溶液〔200μg/ml〕；30%丙烯酰胺溶液；10%的N,N,N’,N’-四甲基乙二胺；10%过硫酸铵溶液；分离胶缓冲液；浓缩胶缓冲液；2*SDS-样品缓冲液；SDS-电极缓冲液；10%SDS;染色液；脱色液；标准蛋白液；3,5-二硝基水杨酸；葡萄糖标准溶液〔0.2mg/ml〕；5%蔗糖〔用0.2mol/lPH4.6醋酸缓冲液配置〕；1mol/lNaCl的0.05mol/LTris-HClPH7.3缓冲液；QSepharose等。1.2方法蔗糖酶粗品的制备将20g鲜酵母倒入250m1锥形瓶中、加入1.6g醋酸钠,搅拌15～20min放入37℃恒温培养箱中保温60h,使得酵母自溶。然后加入10ml蒸馏水,摇匀,再用4℃、15000r／min离心10min,取中间层的液体,重新倒入离心管,再用4℃、15000r／min离心10min。仔细倒出上层清液,用量筒测出体积VA。取出3ml蔗糖酶的初提纯将初提取液A倒入50ml的锥形瓶中,加入4mol/L醋酸3.2ml左右,使溶液的pH值约为4.5左右,摇匀,50℃恒温水浴中保温30min,在保温过程中不断地摇动锥形瓶,取出后迅速在冰浴中冷却,冷却液于4℃、15000r/min离心10min,仔细地倒出上层清夜,测量体积,记为VB,。此提取液为热提取液B。取出3ml用于后续的活力测定,将热提取液B倒入100ml烧杯中,把烧杯放入冰浴中,轻轻搅拌并缓慢加入95%乙醇的溶液,体积与热提取液B相同。整个过程不少于35min,再继续搅拌10min。将烧杯内的液体全部移入离心管中,白色固体保留待用,4℃蔗糖酶的纯化首先用QSepharose凝胶填充离子交换柱,然后,在梯度发生器中的与柱相连接的杯子中加入30ml0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液,在另一只杯中加入30ml含1mol/LNaCl的上述缓冲液。在除尽连接管中的气泡后,在低离子强度溶液的杯子中放入一颗搅拌子。将柱子与恒流泵相连,放松夹子,打开恒流泵,用大于5个柱体积<CV>的0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液进行冲洗。将缓冲液放至刚好与交换剂表面相切,加紧柱下端的夹子,取0.5ml乙醇提取液C缓慢地加到交换柱上,放松柱下端的夹子,使样品刚好全部流进交换剂内,夹紧夹子,再加3ml缓冲液。加样以后的流出液都要收集,每一管收集3ml。将柱子与恒流泵相连,放松夹子,用恒流泵控制流速为3ml/min,每管收集3ml,先用0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液25ml洗穿透锋,接着连接梯度发生器,进行线性梯度洗脱,直到梯度发生器内的缓冲液全部用完为止,再用0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液配制的1mol.LNaCl溶液25ml洗脱。再用0.5mol/L的NaCl洗3CV,再用5CV水洗,对离子交换剂进行再生。在紫外分光光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值,画出管数与吸光度OD值的关系曲线。在滴定板中滴2滴5%蔗糖,再加2滴待测洗脱液,用玻璃棒搅匀,放置5min,浸入葡萄糖试纸,1s后取出,60s比较颜色深浅,用"+"的数目表示酶活力的大小,取活力最高的2～3管为柱分离液D。组号23910111516活力大小+++++++++++++++++++蔗糖酶活力的测定取6支试管,分别按表1-1加入各种试剂。将各试管内液体混合均匀,在沸水浴中加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温,于540nm波长处测OD值,以葡萄糖的毫克数为横坐标,OD值为纵坐标,画出标准曲线。表1-1葡萄糖标准曲线的制作Form1-1theformofmakingglucosestandardcurve’ssample试管号012345葡萄糖00.801.001.201.401.60蒸馏水3.002.202.001.801.601.403,5-二硝基水杨酸1.501.501.501.501.501.50总体积4.504.504.504.504.504.50将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提液A〔1：200〕；热提取液B〔1：200〕；乙醇沉淀提取液C〔1：200〕；柱分离液D〔1：20〕。并取8支试管,按表1-2加入各种试剂。表1-2酶的催化反应Form1-2enzyme’scatalysisreaction项目初提液A〔1：200〕热提取液B〔1：200〕乙醇沉淀提取液C〔1：200〕柱分离液D〔1：20〕加样A对A样B对B样C对C样D对D样酶液/ml2.002.002.002.002.002.002.002.002mol/LNaOH/ml0.05—0.05—0.05—0.05—35℃5%蔗糖〔35℃2.002.002.002.002.002.002.002.00加入蔗糖,立即摇匀开始计时,35℃2mol/LNaOH/ml—0.05—0.05—0.05—0.05总体积/ml4.504.504.504.504.504.504.504.50从每管中按照表格1-3取出反应液〔V测〕进行还原糖的测定,方法和葡萄糖的标准曲线制作相同,如果测得的OD值不在标准曲线X围内,则可增加或减少取样量,直到OD值在标准曲线X围内为止。计算4.5ml溶液中所含还原糖的量〔以葡萄糖计〕,用表格记录下来。蔗糖酶的活力单位定义为：在一定条件下〔pH为4.6、温度为35℃总活力单位数=mg/V测*4.5/2*V总*n式中,mg为V测体积测出的葡萄糖的毫克数；n为酶液稀释倍数；V总为各种提取液在提取过程中得到的总体积。酶的回收率=〔各提取液的总酶活/处提液A的总酶活力〕*100%蔗糖酶蛋白质含量测定与比活力计算将试管从0～5号编码,按表1-3分别加入各试液。试剂A加毕混匀后,静置10min,再向各试管加试剂B后放置10min,再加第二次,每加一次均应立即迅速充分混合。完全加毕后,放置55℃取出试管置冷水中冷却1min。以空白0号为对照,660nm处测定各管OD值,以牛血清蛋白微克数为横坐标。OD660值为纵坐标,用适当比例在标准坐标纸上绘制标准曲线图。将前面所得到的四个部分提取液按照比例稀释。初提液A〔1：100〕,热提取液B〔1：100〕,乙醇提取液C〔1：20〕,D不稀释,从中各取出0.5ml进行蛋白质含量测定。从标准曲线上查知对应蛋白微克数,计算出总蛋白量和比活力。表1-3标准曲线配制加样表Form1-3theformofmakingstandardcurve’ssample试试剂量/ml所加试剂管号012345标准牛血清蛋白液/ml00.20.40.60.81.0H2O/ml4.54.34.13.93.73.5试剂A/ml1.01.01.01.01.01.0试剂B/ml第一次0.30.30.30.30.30.3第二次0.20.20.20.20.20.2总体积/ml6.06.06.06.06.06.0OD660计算:总蛋白=〔mg/0.5〕*n*V总比活力=总活力单位/总蛋白微量凯氏定氮法测总蛋白氮再用微量凯氏定氮法测热提取液B的总蛋白,将50ml克氏烧瓶内加入2ml样液。然后各加硫酸钾-硫酸铜混合物约20mg以与浓硫酸2ml。烧瓶口插一小漏斗,烧瓶置通风橱内的消化架上加热消化,开始时应该控制火力,直到消化液透明并呈淡绿色为止冷却,将消化液移到25ml的容量瓶中定容。取100ml锥形瓶2只,洗净,用吸管各加入2%硼酸溶液10.0ml以与混合指示剂4滴。如果瓶内液体呈现葡萄紫色,可以再加硼酸溶液5.0ml,盖好备用。如果锥形瓶内的液体呈现绿色,需要重新洗涤。蒸汽发生器内盛有加入数滴H2SO4的蒸馏水,加热后,产生之蒸汽经过贮藏液、反应室至冷凝管,冷凝的液体流入接受瓶。每次使用前,需要蒸汽洗涤10min左右,然后将一只盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶放置冷凝管下端,并将冷凝管的管口插入酸液内,继续蒸馏1～2min,如硼酸液颜色不变,表示仪器洗净,否则需再洗。移去酸液,蒸馏1min,用水冲洗冷凝管口,吸取反应室残液。在冷凝管下放置一盛有硼酸液以与指示剂的锥形瓶,并使得冷凝管口插入酸液液面下约0.5cm处。取5ml消化液,由小漏斗加入反应室,用蒸馏水洗涤小漏斗,洗涤液由小漏斗流入反应室。用小量筒量取10ml30%NaOH溶液,倒入小漏斗,放松弹簧夹,让NaOH溶液缓缓流入反应室,当小漏斗内仍有少量NaOH溶液时,加紧夹子,再加约有3ml蒸馏水于小漏斗内,同样缓缓放入反应室,并留有少量水在漏斗内作水封。至此,即可蒸馏。开始蒸馏后立即注意硼酸溶液颜色的变化,当酸液由葡萄紫变成绿色后,再蒸馏3min。然后降低锥形瓶,使得冷凝管口离开酸液液面约1cm。再蒸馏1min,用少量蒸馏水冲洗冷凝管口,移去锥形瓶,盖好,准备滴定。每一次反应结束后,必须把反应室内的残液吸去,洗净；即为切断电源,让贮液管温度突然下降,即可使反应室残液吸至贮液。用0.01mol/LHCl溶液滴定锥形瓶中的硼酸液至淡葡萄紫色,记录所消耗的HCl溶液量。样品含氮量〔mg/ml〕=〔A-B〕*N*14.008*V2/V1*V2式中A——滴定样品用去的HCl溶液体积,ml；B——滴定空白用去的HCl溶液体积,ml；N——盐酸的摩尔浓度,mol/L14.008——每摩尔氮原子质量,g/mol;V1——烧瓶内加入样液的体积,mlV2——消化液转移到容量瓶中定容的体积,mlV3——加入反应室的消化液体积,ml计算所得结果为样品总氮含量,如欲求蛋白质含量,用蛋白氮乘以6.25即得。SDS测蛋白质的相对分子质量将玻璃板洗净、干燥后装置成凝胶膜,保证其不漏水。按下列比例配置12%的分离胶：分离胶缓冲液2.5ml,30%丙烯酰胺贮存液4.0ml,10%SDS0.1ml,10%过硫酸铵溶液0.1ml,加水3.3ml,混合均匀后,加入10%TEMED40μl。迅速混合后倒入两块玻璃板之间,小心用移液枪加进一层水覆盖,让其聚合30～60min。分离胶高度约占玻璃板高度的2/3左右。分离胶聚合好后,出去水层,用滤纸条吸干。按下列比例配置浓缩胶：浓缩胶缓冲液0.5ml,30%丙烯酰胺贮存液0.67ml,10%过硫酸铵溶液40μl,加水2.7ml,混合均匀后,加入10%TEMED40μl,迅速混合后,倒在分离胶上层,并插入梳子,聚合后,小心取出梳子,避免混入气泡,用滤纸去掉样品槽内的水分。将样品和标准蛋白质溶液分别与2*SDS-样品缓冲液等体积混合,100℃水浴加热3～5min。将制备好的凝胶平板装进垂直平板电泳槽。下槽放进SDS-电极缓冲液,凝胶底部保证没有气泡。将与SDS-样品缓冲液混合后的样品液和标准蛋白各20μ在电极槽中倒入pH8.3Tris-HCl电极缓冲液,内含有0.1%SDS即可进行电泳。开始时电流为10mA左右,待样品进入分离胶后,改为20～30mA,当染料前沿距离凝胶底部边缘1.5cm时候,停止电泳关闭电源。电泳结束后,取出凝胶平板,移去玻璃板,将凝胶浸泡于染色液中,染色4h或过夜,然后用脱色液脱色,数小时换一次脱色液,直至背景无色。凝胶脱色后,可浸泡在7%醋酸溶液中保存,也可放在一X与胶片尺寸相宜的滤纸上。以标准蛋白质相对分子质量的对数〔lgMw〕为纵坐标,相对迁移距离为横坐标作图,得到标准曲线。然后根据样品蛋白质分子的相对迁移距离,从标准曲线上查出其相对分子质量。相对迁移距离=蛋白质分子迁移距离〔cm〕/染料迁移距离〔cm〕结果与分析2.1初步提纯样品体积表2-1初提纯各样品体积Form2-1thevolumeofeachpurifiedsample组别样品A样品B样品C体积/ml15.313.95.2总体积/ml15.317.38.22.2QSepharose层析柱法由于实验时,误将9号试管内的分离液倒掉,又将3号试管与10号试管混合,这将会造成后面的活性测试实验一连续的影响,这导致后面的结果均要将此考虑进去。图2-1出管数与吸光度OD值的关系曲线图Picture2-1thecurveofODandtubes2.3蔗糖酶活力测定图2-2葡萄糖标准曲线图Fig2-2Thestandercurveofglucose表2-2各提取液的活力与回收率Form2-2theactivityofeachextractingsolutionandrecovery项目初提液A热提取液B乙醇提取液C柱分离液D总活力单位数/U11475934257272959回收率/%10081.449.925.8在热提取液B到乙醇提取液C的过程中,蔗糖酶损失的最多,高达30%,可知在乙醇提纯过程中,冰浴并不充分,温度并不足够的低,或者说乙醇在滴加时,速率过大,导致局部乙醇的浓度过大,使得蔗糖酶发生了不可逆的形变。柱分离损失了24%的主要从浓度梯度的变化时候从柱体上过早脱落下来的酶。或者是说酶没有完全的固定在交换柱上面。与此同时,制作一个线性关系良好的葡萄糖标准曲线也是起着关键作用。2.4蔗糖酶蛋白质量测定与比活力计算FForm2-2Thestandercurveofprotein表2-3标准曲线配制加样表Form2-3theformofmakingstandardcurve’ssample试试剂量/ml所加试剂管号012345标准牛血清蛋白液/ml00.20.40.60.81.0H2O/ml4.54.34.13.93.73.5试剂A/ml1.01.01.01.01.01.0试剂B/ml第一次0.30.30.30.30.30.3第二次0.20.20.20.20.20.2总体积/ml6.06.06.06.06.06.0OD6600.000.2030.3230.4430.5630.683表2-4酵母蔗糖酶的纯化Form2-4purificationoinvertasefromyeastStepVtotal<ml>Totalactivity<U>Protein<mg>SpecificActivity<U/mg>Proteinyield<%>Enzymeyield<%>Purification<fold>SampleA15.311934380.35831.381001001SampleB17.310587.6222.47847.5958.588.71.5SampleC8.3572733.631170.298.8447.95.4SampleD109.32959.232.19991.908.4724.82.9提取液B到提取液C时,其内含的蛋白质含量急剧下降了6.6倍,大量的杂蛋白被出去,虽然因此失去了54%的酶活性,但是也能看出用乙醇来提取蔗糖酶的选择性很高,其比活力也从1.5直接上升了3.6倍,达到了5.4。从数据中,我们可以得到样品D的比活力不如样品C的比活力要高,这不是方法的问题,而是在柱层析的结尾时,我不小心将提纯出来的液体倒掉,为了后续实验的进行。我将有穿透峰的收集液充当产品收集。2.5微量凯氏定氮法测总蛋白表2-5样品含氮量的记录Form2-5therecordofthenitrogencontentofsample组别123456平均滴定所用HCl〔ml〕2.803.332.974.463.083.542.95样品含氮量〔mg/ml〕27.4632.6529.1243.7330.2034.7128.93由实验结果中可以得到,原来的sampleB体积为19.7ml,可得到sampleB中有3561.76mg的蛋白质,显然与用Folin-酚法,测出来的数据相差甚远,再与同学的数据相比较,认识到本实验是一个失败的实验,得到了极为不准确的数据。造成实验失败的原因：1.使用前,微量凯氏定量仪没有清洗干净,内壁沾有硫酸没有洗干净。2.两组使用的5%硼酸在使用前已经被污染了。3.在实验过程中发生了倒吸现象,后没有清洗干净。2.6SDS测定蛋白质的相对分子质量FigFig2-6Thestandercurveofprotein图2-6蛋白质标准曲线Fig2-6Thestandercurveofprotein表2-7各组条带蛋白质相对分子质量Form2-7Relativemolecularmassofeachprotein组别条带1条带2条带3条带4条带5标准9740066200430003100020100B9386269464536673416623706C959036654034909D69464图2-8电泳结果图Fig2-8theresultofelectrophoresis从电泳结果得到的样品D中的蛋白质的相对分子质量来看,蔗糖酶的相对分子质量为69464。在网上查阅了相关资料后,得到了酵母内的蔗糖酶的相对分子质量大约在710000左右,电泳的图样呈带状,且颜色比较淡,从而在测量其长度时,造成了一定的误差。同时,我也看到了在标准曲线上,该回归线的线性关系,不是十分良好,这主要是在电泳时,夹板过紧而导致胶带被挤出来。从另一个角度来看,我们也可以观察到,样品内的带数在慢慢的减少,也可以反映出在此过程中样品内的杂蛋白在一次次地减少,A到B热提取过程中,大量种类的杂蛋白被出去。讨论3.1酵母蔗糖酶提取其他方法比较酵母蔗糖酶的提取较常使用甲苯自溶法,除此还有冻融法和SDS抽提法。表3-1不同蔗糖酶提取方法比较[10]Form3-1comparingwithdifferentwaytoextractsucrose蔗糖酶提取方法提取液酶活性实验优点实验缺陷甲苯自溶法偏低试剂简单、价格低廉其耗时长、重复性差、酶活性低冻融法一般,是甲苯自溶的534倍。可以确定